小檗堿改善多囊卵巢綜合征大鼠卵巢功能及其機(jī)制

姚琳琳，楊麗，王華莉

多囊卵巢綜合征以月經(jīng)紊亂、排卵障礙、肥胖、不孕等為主要特征，是一種常見的導(dǎo)致女性不孕的綜合征之一，其發(fā)病率在育齡婦女中約為10%，嚴(yán)重者還可以引起糖尿病、子宮內(nèi)膜癌、高血壓等疾病的發(fā)生［1-2］。多囊卵巢綜合征的發(fā)生與雄激素、胰島素過量分泌等有關(guān)，以胰島素抵抗、腎上腺內(nèi)分泌功能異常為主要特征［3］。小檗堿是分離自黃連中的一種生物堿，又稱為黃連素，廣泛存在于植物中，其具有抗腫瘤、抗肺結(jié)核、消炎等功效［4］。研究顯示，小檗堿對于多囊卵巢綜合征具有一定的治療效果［5］。本實驗于2017年3—6月通過構(gòu)建多囊卵巢綜合征大鼠模型，用小檗堿灌胃處理，探討小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠模型胰島素水平及卵巢功能中的作用，為小檗堿治療多囊卵巢綜合征提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料SD雌性大鼠80只，體質(zhì)量范圍為48～58 g，23日齡，購于鄭州大學(xué)動物實驗室（醫(yī)學(xué)實驗動物使用許可證號：SCXK（豫）2017-0008，合格證號：豫檢證字第2017A023號）；胰島素含量測定試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；瘦素（Leptin）含量測定試劑盒購于上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司；黃體生成素（luteinizing hormone，LH）含量測定試劑盒購于瑞士ALEXIS公司；促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）含量測定試劑盒購于江蘇菲亞生物科技有限公司；睪酮（testosterone）含量測定試劑盒購于武漢艾美捷科技有限公司；胰島素樣生長因子I（insulin-like growth factor-I，IGF-I）、瘦素、胰島素樣生長因子I受體（insulin-like growth factor-IR，IGF-IR）、胰島素受體（insulin receptor，IR）引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Real-time PCR，qPCR）試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2多囊卵巢綜合征大鼠模型構(gòu)建及分組處理按照隨機(jī)數(shù)字表法取SD雌性大鼠構(gòu)建多囊卵巢綜合征大鼠模型構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)［6］，以脫氫表雄酮構(gòu)建，簡述如下。

大鼠在實驗前適應(yīng)性飼喂1周，飼養(yǎng)溫度為18～23℃，濕度40%～50%，自由飲水和飲食，12 h晝夜交替。在大鼠的頸背部的皮下注射0.06 mg/g的脫氫表雄酮和0.2 mL的甘油（在實驗前充分混合），連續(xù)注射20 d。SD大鼠分為：正常組、模型組、小檗堿組、二甲雙胍組，每組20只。模型組、小檗堿組、二甲雙胍組大鼠進(jìn)行多囊卵巢綜合征大鼠模型構(gòu)建，正常組注射等量的甘油。同時小檗堿組用小檗堿濃度為200 mg/kg進(jìn)行灌胃處理，每天1次，連續(xù)灌胃21 d。二甲雙胍組用二甲雙胍濃度為170 mg/kg進(jìn)行灌胃處理，每天1次，連續(xù)灌胃21 d。模型組和正常組用等量的生理鹽水灌胃。

本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.3標(biāo)本采集分別在最后一次給藥后1 h，測定大鼠的體質(zhì)量。用10%的水合氯醛麻醉各組大鼠，按照100 g體質(zhì)量0.3 mL劑量麻醉，以腹主動脈穿刺法采集全血，在室溫中靜置約60 min后，1 500 g離心10 min，收集上清液，保存于-80℃。同時收集卵巢組織及子宮組織，測定卵巢組織及子宮組織的質(zhì)量。

1.4成熟卵泡數(shù)目和黃體數(shù)目統(tǒng)計取卵巢組織，切成4 μm厚的組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。用二甲苯常規(guī)脫蠟以后用濃度梯度乙醇水化，置于蘇木素中染色10 min后，用自來水洗滌，以1%的鹽酸乙醇分化2 s，自來水沖洗以后，氨水洗2 s，將浮色洗去，伊紅染色液染色2 min，放在無水乙醇中孵育2 s，常規(guī)方法透明，中興樹膠封片。再按照隨機(jī)數(shù)字表法選取5個切片，在顯微鏡下計數(shù)成熟卵泡數(shù)目和黃體數(shù)。成熟卵泡：卵丘明顯，卵泡腔很大，卵泡內(nèi)膜細(xì)胞緊靠卵泡顆粒層，與顆粒層之間有一層基膜相隔，胞質(zhì)清亮，胞核圓形，細(xì)胞間有很多毛細(xì)血管，外膜細(xì)胞位于外層，與周圍結(jié)締組織界限不明顯。黃體：近似于球體，排卵后殘留的卵泡壁塌陷，卵泡膜結(jié)締組織、毛細(xì)血管伸入到顆粒層，體積較大。

1.5血清中LH、FSH、睪酮、瘦素、胰島素水平檢測取各組大鼠血清，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清中LH、FSH、睪酮、瘦素、胰島素水平，步驟參照試劑盒說明書。

1.6qPCR測定卵巢組織中IGF-I、瘦素、IGF-IR、IR表達(dá)取各組大鼠卵巢組織，按照每100 mg組織中添加2 mL的Trizol試劑提取組織中的總RNA，RNA溶解于DEPC水中，測定OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間。取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參數(shù)為：37℃，40 min；70℃，10 min。取cDNA，進(jìn)行qPCR，用β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，計算各組IGF-I、瘦素、IGF-IR、IR mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件分析，計量資料用±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠模型體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量、子宮質(zhì)量、成熟卵泡數(shù)、黃體數(shù)影響模型組多囊卵巢綜合征大鼠較正常組體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量明顯升高，子宮質(zhì)量明顯降低，成熟卵泡數(shù)和黃體數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)小檗堿灌胃治療后的大鼠較模型組體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量降低，成熟卵泡數(shù)和黃體數(shù)明顯增加，子宮質(zhì)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 瘦素、IGF-I、β-actin、IGF-IR、IR引物序列

2.2小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠模型血清中LH、FSH、睪酮、瘦素水平影響模型組多囊卵巢綜合征大鼠血清中LH、FSH、睪酮、瘦素較正常組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)小檗堿治療后的大鼠血清中LH、FSH、睪酮、瘦素水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠模型血清中胰島素水平影響模型組多囊卵巢綜合征大鼠血清中胰島素水平較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)小檗堿治療后的大鼠血清胰島素水平較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠血清中胰島素水平影響

2.4小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠模型卵巢組織中IGF-I、瘦素、IGF-IR、IR mRNA相對表達(dá)量影響模型組多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織中IGF-I、瘦素、IGF-IR、IR mRNA相對表達(dá)量水平較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)小檗堿治療后的大鼠卵巢組織中IGF-I、瘦素、IGF-IR、IR mRNA相對表達(dá)量水平較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

3 討論

多囊卵巢綜合征的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其中下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常、胰島素抵抗是胰島素及雄激素分泌過多等內(nèi)分泌特征發(fā)生的重要原因［7-8］。多囊卵巢綜合征病人垂體對促性腺激素釋放激素的敏感性大大增加，病人分泌的LH過多，而持續(xù)高水平的LH可以誘導(dǎo)卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生大量的雄激素，雄激素過多可以阻礙卵泡的成熟［9］。多囊卵巢綜合征還與胰島素抵抗有關(guān)，胰島素抵抗是指組織對胰島素的敏感性異常下降，導(dǎo)致胰島素的生物學(xué)功能下降［10］。機(jī)體內(nèi)過多的胰島素可以通過作用于垂體上的IR，誘導(dǎo)垂體釋放大量的LH，促進(jìn)卵巢分泌雄激素，影響卵巢功能的發(fā)揮，LH可以促進(jìn)閉鎖卵泡素分泌雄激素，這些雄激素在皮下脂肪組織中被芳香化生成雌激素，而高水平的雌激素可以進(jìn)一步誘導(dǎo)LH的分泌，閉鎖卵泡素可以促進(jìn)FSH抑制素的分泌，導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻，形成惡性循環(huán)，在多囊卵巢綜合征病人中存在LH異常升高和LH/FSH升高現(xiàn)象［11］。本實驗表明，多囊卵巢綜合征大鼠模型大鼠體質(zhì)量明顯增加，并且其卵巢質(zhì)量也明顯升高，黃體數(shù)和成熟的卵泡數(shù)目減少，大鼠血清中LH、睪酮水平升高，胰島素水平也升高，說明成功構(gòu)建了多囊卵巢綜合征大鼠模型。

表2 小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠模型體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量、子宮質(zhì)量、成熟卵泡數(shù)、黃體數(shù)影響/±s

表2 小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠模型體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量、子宮質(zhì)量、成熟卵泡數(shù)、黃體數(shù)影響/±s

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組小檗堿組二甲雙胍組F值P值鼠數(shù)20 20 20 20體質(zhì)量/g 147.25±12.36 174.32±11.23a 162.17±11.25b 160.25±12.34b 17.615 0.000卵巢質(zhì)量/mg 217.32±10.47 328.93±12.52a 289.64±18.59b 286.45±23.68b 146.808 0.000子宮質(zhì)量/mg 322.61±21.65 224.17±18.62a 267.16±20.33b 269.68±10.63b 96.852 0.000成熟卵泡數(shù)4.36±0.69 1.32±0.12a 2.84±0.24b 2.92±0.26b 200.340 0.000黃體數(shù)4.12±0.42 0.92±0.10a 2.64±0.22b 2.62±0.13b 543.748 0.000

表3 小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠血清中激素水平影響/±s

表3 小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠血清中激素水平影響/±s

注：LH為黃體生成素，F(xiàn)SH為促卵泡生成素。與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組小檗堿組二甲雙胍組F值P值鼠數(shù)20 20 20 20 LH/（pg/mL）2 504.31±214.31 8 932.47±654.81a 4 172.58±345.18b 4 146.21±417.65b 801.488 0.000 FSH/（ng/mL）15.24±1.64 42.17±3.28a 20.84±1.51b 20.10±1.32b 657.415 0.000睪酮/（pg/mL）1 241.85±112.64 3 057.69±217.34a 1 467.92±112.36b 1 442.38±117.48b 658.233 0.000瘦素/（ng/mL）0.92±0.08 2.35±0.21a 1.14±0.11b 1.10±0.10b 473.269 0.000

表5 小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織中IGF-I、瘦素、IGF-IR、IR mRNA相對表達(dá)量影響/± s

表5 小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織中IGF-I、瘦素、IGF-IR、IR mRNA相對表達(dá)量影響/± s

注：IGF-I為胰島素樣生長因子I，IGF-IR為胰島素樣生長因子I受體，IR為胰島素受體。與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組小檗堿組二甲雙胍組F值P值鼠數(shù)20 20 20 20 IGF-I mRNA 1.00±0.09 2.64±0.26a 1.84±0.15b 1.85±0.13b 311.723 0.000瘦素mRNA 1.00±0.10 1.87±0.16a 1.40±0.11b 1.43±0.10b 175.298 0.000 IGF-IR mRNA 1.00±0.07 2.36±0.22a 1.72±0.13b 1.73±0.14b 275.241 0.000 IR mRNA 1.00±0.12 1.95±0.12a 1.47±0.13b 1.42±0.10b 217.068 0.000

小檗堿具有抗菌、消炎、增加免疫力、改善竇房結(jié)功能，對于多囊卵巢綜合征也具有一定的治療作用［12-14］。在多囊卵巢綜合征病人中，肥胖的發(fā)生率高于40%，在經(jīng)過小檗堿調(diào)節(jié)以后，病人的血脂、腰圍、胰島素敏感性等均有不同程度的改善［15］。臨床的研究表明，小檗堿可以有效提高多囊卵巢綜合征病人的妊娠率，對于月經(jīng)周期及排卵具有一定的改善作用［16］。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)小檗堿灌胃治療后的大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量降低，成熟卵泡數(shù)和黃體數(shù)明顯增加，子宮質(zhì)量升高。同時我們的研究還發(fā)現(xiàn)，小檗堿組與二甲雙胍組對多囊卵巢綜合征大鼠的多種指標(biāo)影響差異不大，提示小檗堿治療多囊卵巢綜合征可達(dá)到與二甲雙胍相似的結(jié)果。但有研究表明二甲雙胍作為胰島素增敏劑治療多囊卵巢綜合征，病人胃腸道反應(yīng)較大［17］。

IGF-I在胰島素和卵巢的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵的紐帶作用，其主要存在于卵巢中，可以影響卵巢間質(zhì)和卵泡的功能，IGF-I能夠獨立或者協(xié)同促性腺激素調(diào)節(jié)性激素的合成、排卵后的黃體期維持、卵巢周期性優(yōu)勢卵泡選擇，IGF-I高表達(dá)可以誘導(dǎo)卵巢間質(zhì)血流增多，誘導(dǎo)蛋白和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，高水平的IGF-I可以誘導(dǎo)多囊卵巢發(fā)生，高水平的胰島素可以刺激卵巢組織上的IR或者通過IGF-IR誘導(dǎo)雄性激素的產(chǎn)生，放大促性腺激素的作用，引起卵巢多囊改變［18］。脫氫表雄酮由腎上腺皮質(zhì)合成，是合成睪酮過程中的一個產(chǎn)物，其可以經(jīng)過相關(guān)蛋白酶的作用后生成睪酮，在多囊卵巢綜合征病人中表達(dá)升高，睪酮是女性體內(nèi)較為重要的雄性激素，在正常女性中水平較低，在多囊卵巢綜合征女性中水平明顯升高，其可能與雄激素受體或LH受體作用影響子宮內(nèi)膜增生和黃體期子宮內(nèi)膜的分泌，影響胚胎的著床，引發(fā)流產(chǎn)［19］。瘦素是由肥胖基因編碼產(chǎn)生的蛋白，在白色的脂肪組織中廣泛表達(dá)，不僅參與肥胖的發(fā)生，還與不孕等有關(guān)［20］。近年來的研究顯示，瘦素與排卵障礙有關(guān)［21］。本實驗的研究表明，小檗堿下調(diào)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織IGF-I、Leptin、IGF-IR、Insulin R mRNA表達(dá)，小檗堿可以通過抑制胰島素從而改善多囊卵巢綜合征大鼠雄性激素睪酮的產(chǎn)生，作用機(jī)制可能與下丘腦-垂體-卵巢軸，以后尚需檢測這些受體的蛋白表達(dá)水平加以證實。

綜上，小檗堿具有改善大鼠多囊卵巢綜合征的作用，能夠促進(jìn)卵巢卵泡生長及排卵，下調(diào)卵巢組織中IGF-I、瘦素、IGF-IR、IR mRNA相對表達(dá)量水平。多囊卵巢綜合征發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其中激素水平異常、胰島素抵抗等是目前認(rèn)為治療多囊卵巢綜合征的重點，本實驗存在一定的不足之處，沒有探討小檗堿對大鼠的毒性作用，在以后的實驗中，會對小檗堿上述作用的具體機(jī)制及毒性作用深入研究。