外泌體與骨質(zhì)疏松相關(guān)研究進展

朱世壯 楊大志

1. 廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000

2. 廣東醫(yī)科大學(xué)，深圳市第六人民醫(yī)院脊柱外科，廣東 深圳 518000

骨質(zhì)疏松癥是一種由多種原因?qū)е碌墓敲芏葴p低及骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)退化致使骨脆性增加的全身性代謝性疾病[1-2]。隨著年齡的不斷增長，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率亦日漸增加。因此診斷和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥及減少其并發(fā)癥成為重要的公共衛(wèi)生問題。針對骨質(zhì)疏松癥，其藥物治療是目前研究的熱點。但任何疾病，治療固然重要，而預(yù)防都應(yīng)放在第一位。除了指導(dǎo)有高危因素的人群采取合理的預(yù)防措施，如進行適當(dāng)?shù)腻憻捈皥猿址免}片等藥物外，還應(yīng)從科研醫(yī)務(wù)工作者出發(fā)努力研發(fā)能夠預(yù)測骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物，從而有效達到一級預(yù)防的目標(biāo)。目前，外泌體已被證實在骨代謝中發(fā)揮著極其重要的作用。最近的研究也表明外泌體在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及調(diào)節(jié)細胞間通信中發(fā)揮重要作用。本文通過綜述近年來骨來源外泌體的研究進展，期待為骨質(zhì)疏松癥的診斷及治療提供新的思路。

1 外泌體的結(jié)構(gòu)及功能

1.1 外泌體的來源及成分

外泌體是由間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等體內(nèi)多種細胞產(chǎn)生并分泌且具備脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的直徑在30～200 nm之間的囊泡。其內(nèi)包含多種生物活性物質(zhì)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA及microRNA等，且通過主動分泌的方式分泌到機體的組織液中[3-4]。

1.2 外泌體的獲取及轉(zhuǎn)運檢測方式

可以通過檢測相應(yīng)的組織液如血液、唾液、精液等，達到監(jiān)測、獲取以及分析外泌體的目的。因此可以從骨髓中提取得到骨髓間充質(zhì)造血干細胞來源的外泌體。相關(guān)研究表明，在-20 ℃條件下儲存5年幾乎不影響血microRNA的總體數(shù)量，即在不同溫度和不同儲存時間下血漿外泌體中循環(huán)microRNA具備較強的穩(wěn)定性[5-6]。目前，通過超速離心和蔗糖梯度離心法，即可以得到相對質(zhì)量較高的外泌體。在這方面，超濾法、親和層析法及沉淀法亦各有優(yōu)缺點，可根據(jù)自我實驗的要求及目的，選擇適當(dāng)?shù)姆椒╗7]。

隨著研究的進一步深入，從體液、細胞甚至組織等材料中分離外泌體的方法也日益成熟。以上這些特性，使得外泌體microRNA在生物標(biāo)志物方面具備極高的應(yīng)用前景。

1.3 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體通過與靶細胞結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)作用。而大量研究表明，不同細胞來源的外泌體，其生物學(xué)功能亦不盡相同。而骨細胞來源的外泌體具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，其中，Qin等[8]指出，外泌體可以通過調(diào)節(jié)骨生成和血管生成發(fā)揮刺激骨再生的作用。一方面外泌體具備參與除細胞外介質(zhì)的信息傳遞和交流的作用；另一方面，對不同骨細胞，外泌體具有一定的修復(fù)及促進再生的作用，并以此來調(diào)控骨組織的正常及病理狀態(tài)[9-10]。

2 骨來源外泌體與骨質(zhì)疏松癥

2.1 外泌體microRNAs

近年來，關(guān)于外泌體內(nèi)microRNA如何調(diào)節(jié)受體細胞功能及活性已成為相關(guān)領(lǐng)域研究熱點。外泌體中富含多種microRNAs，且骨來源的外泌體中microRNA在骨平衡中具備重要的作用。已知，microRNA通過調(diào)控成骨細胞及破骨細胞的分化及活性，介導(dǎo)骨質(zhì)疏松的發(fā)生及發(fā)展。microRNAs轉(zhuǎn)錄后通過調(diào)控調(diào)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從而控制成骨細胞及破骨細胞的生物活性[11]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展亦伴隨著多種microRNA表達的異常[12]。而通過檢測骨組織來源的外泌體中所含microRNA種類、含量及活性改變的情況，便可以為骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防、診斷乃至治療及預(yù)后提供新的思路。未來，亦有可能將骨起源的外泌體作為骨疾病尤其是骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物。

徐月新[13]指出，microRNA轉(zhuǎn)錄水平或microRNA 分泌水平的特異改變都和骨骼疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，microRNA 在調(diào)控骨重構(gòu)的成骨細胞及破骨細胞的分化和活性方面具備極其重要的作用。Ell等[14]研究發(fā)現(xiàn)，血清中sICAM1和兩種破骨細胞microRNA(miR-16和miR-378)的水平在破骨細胞分化中升高，表明其與骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；而功能研究表明，異位表達下調(diào)miR-141和miR-219后，破骨細胞發(fā)育受損和骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險降低。這些發(fā)現(xiàn)證明miRNAs在骨轉(zhuǎn)移過程中破骨細胞發(fā)生的重要調(diào)控因子和潛在的治療靶點和生物標(biāo)志物，即miRNAs有成為骨轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點和臨床生物標(biāo)志物的可能[14]。

目前已明確報道，骨起源的外泌體中，與骨重建相關(guān)的microRNA有l(wèi)et-7、miR-10b-5p、miR-24、miR-199b、miR-143-3p、miR-214-3p 、miR-218。有研究通過分析骨質(zhì)疏松癥組與骨量減少組共372個共同表達的miRNA，得出均與正常對照組有差異的microRNA，共39個，其中5個miRNA表達量較高且具有較為顯著的差異，分別為miR-584-5p、miR-92a-3p、miR-484、m222-3p、miR-155-5pP。這些篩選出來的microRNA，極可能成為骨量減少乃至骨疾病如骨質(zhì)疏松癥的潛在分子標(biāo)志物，具有極強的應(yīng)用前景[15]。進一步研究[16]發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p可以選擇性抑制RANKL誘導(dǎo)激活的大鼠BMMs中的NFATc1，進一步減少了骨吸收必需的骨吸收酶的釋放，從而達到緩解骨溶解的作用。以上這些miRNA將成為未來骨質(zhì)疏松癥分子生物學(xué)的重點研究對象，為骨質(zhì)疏松癥的早期預(yù)防、診斷及治療提供重要的分子生物學(xué)參考。然而，骨組織來源的microRNA在骨細胞間信息交流的具體機制及其作用靶點還需要進一步研究[17]，為后續(xù)其在骨組織生物學(xué)方面的應(yīng)用提供更多的實驗依據(jù)。

2.2 外泌體與破骨細胞

有研究[18]顯示，miR-21的表達受破骨細胞形成的轉(zhuǎn)錄因子特別是c-Fos的控制，RANKL刺激的miR-21表達可能是破骨細胞形成的必要條件。miR-21可能是治療具有過度破骨細胞發(fā)育和活性的骨代謝疾病(如骨質(zhì)疏松癥)的新靶點。未來，破骨細胞microRNA中有可能成為破骨細胞異?；钚约膊∪绻琴|(zhì)疏松癥的潛在治療靶點。當(dāng)然，目前尚缺少下一步的體內(nèi)研究，但可以肯定的是，miR-21在治療骨質(zhì)疏松等破骨細胞的過度發(fā)育及其活性功能紊亂性疾病中成為治療的靶點。

在Deng等[19]的研究中，PTH處理UAMS-32P細胞制備的外泌體可顯著促進破骨細胞前體分化的功能可以通過添加RANKL抗體或骨保護素來阻止。而通過活化T細胞核因子的易位(這是對RANKL反應(yīng)的破骨形成的主要調(diào)節(jié)因子)，表明了PTH處理的UAMS-32P細胞釋放的外泌體激活了NFATc1核易位，證實了由外泌體介導(dǎo)的RANKL蛋白從成骨細胞轉(zhuǎn)移到破骨細胞前體后具備誘導(dǎo)破骨細胞形成的功能。體外實驗[20]表明，miR-128通過miR-128/SIRT1/NF-kB信號軸調(diào)控破骨細胞形成，過表達或抑制miR-128可分別顯著增加或減少破骨細胞的生成。不難發(fā)現(xiàn)，外泌體對破骨細胞的作用可能具有雙向性，其影響骨重建的分子機制尚未明確，這也是接下來我們進行體外及體內(nèi)實驗所研究的重點方向。

2.3 外泌體與成骨細胞

成骨細胞來源于間充質(zhì)干細胞，具備進一步發(fā)育成為骨細胞的潛能。在適宜的刺激下，成骨細胞經(jīng)歷增殖與成熟，通過合成分泌骨基質(zhì)及相關(guān)蛋白調(diào)控骨形成過程[21]。破骨細胞主要通過外泌體分泌miR214-3p。Li等[22]檢測到，破骨特異性miR-214-3p敲入小鼠的血清外泌體中miR-214-3p顯著升高，進一步分析目標(biāo)小鼠的骨表型，發(fā)現(xiàn)其骨形成減少，證明外泌體miR214-3p在體外靶向成骨細胞抑制骨形成；而通過每周脈沖注射antagomiR214-3p，通過骨組織形態(tài)學(xué)分析顯示骨形成和骨吸收相關(guān)參數(shù)幾乎恢復(fù)至野生型小鼠的水平，進一步證明了破骨靶向的antagomir-214-3p治療可恢復(fù)骨生成。因此，miR-214-3p可能用于骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松的診療。徐軼爾等[23]通過生物信息學(xué)分析，表明與成骨分化相關(guān)的不同外泌體miRNA模式的量化表達豐富，其中RNA降解、mRNA監(jiān)測通路、Wnt信號通路、RNA轉(zhuǎn)運通路最為顯著。這些數(shù)據(jù)表明了外泌體microRNA是成骨細胞分化的調(diào)節(jié)因子。在RANKL 再生及骨重建等方面，Wnt 信號通路均起到極其重要的調(diào)節(jié)作用，其已被視為骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。通過進一步分析成骨細胞起源的外泌體中的microRNAs，得知表達明顯升高的microRNA包含：miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p、miR-335-3p、miR-378 和miR-378b以及miR-677-3p等，它們共同作用于Wnt 信號通路，從而促進成骨細胞分化。

一方面，目前大多數(shù)研究尚局限于檢測出同骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的microRNA，而對于其影響骨質(zhì)疏松進展的具體機制尚需進一步深入研究；另一方面，尚缺少大量的臨床實驗來進一步驗證以上通路中microRNA所起的具體作用，尤其是其在具體疾病的治療方面仍存在極大的研究空間。由于microRNA通過調(diào)控成骨細胞及破骨細胞進一步介導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生及進展，因此，對于外泌體同成骨細胞亦或破骨細胞之間的關(guān)系，大多都可以聯(lián)系到外泌體中microRNA的變化?；蛘?，可以將microRNA視為外泌體介導(dǎo)甚至治療骨質(zhì)疏松癥的重點研究對象。

2.4 外泌體與骨髓間充質(zhì)干細胞

骨髓間充質(zhì)干細胞作為成骨細胞前體，越來越多的骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體被報道應(yīng)用于各種動物實驗。其中，F(xiàn)uruta等[24]認為外泌體是間充質(zhì)干細胞旁分泌信號通路的一種新因子，且其在組織修復(fù)過程中具備重要的作用。Zhang等[25]初次證明了人類胚胎間充質(zhì)干細胞外泌體具有軟骨修復(fù)的生物學(xué)效應(yīng)，并指出間充質(zhì)干細胞外泌體可以用于間充質(zhì)干細胞治療替代療法。徐軼爾等[23]報道了在骨髓間充質(zhì)細胞成骨分化過程中，外泌體來源的miRNA的表達程度不盡相同。其中參與介導(dǎo)mRNA監(jiān)測及Wnt通路等信號通路的miRNA共有79種。Phinney等[26]指出，在骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)中的作用方面，盡管外泌體還存在許多疑惑，但其指出了應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體具有以下幾個優(yōu)勢：首先，它們的使用避免了可能發(fā)生突變或損壞DNA的細胞的轉(zhuǎn)移。第二，相較于骨髓間充質(zhì)干細胞太大且不易通過毛細血管循環(huán)而言，外泌體囊泡小且容易循環(huán)，許多骨髓間充質(zhì)干細胞不能通過第一通道毛細血管床，通常是肺(盡管有些能明顯通過)。第三，移植后注入的骨髓間充質(zhì)干細胞的劑量會迅速減少，而且骨髓間充質(zhì)干細胞來源的囊泡的輸送可能會達到比大細胞更大程度循環(huán)的更高 “劑量”。Zuo等[27]通過將骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體靜脈注射至因輻射導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的小鼠體內(nèi)，通過顯微CT觀察小鼠脛骨并進行組織形態(tài)學(xué)分析，得出骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體通過恢復(fù)受體骨髓間充質(zhì)干細胞的功能發(fā)揮抗骨量丟失的作用，并以此提出外泌體在無細胞治療方面具備極高的應(yīng)用前景。

以上相關(guān)研究表明骨質(zhì)疏松癥的治療，不僅僅局限于成骨細胞及破骨細胞的層面，相較于單純的成骨細胞而言，成骨細胞前體即骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體具有更大的優(yōu)勢。因此，其在抗骨質(zhì)疏松疾病中的骨量丟失方面亦具有極高的應(yīng)用前景。

3 外泌體治療骨質(zhì)疏松相關(guān)研究

Youssef等[28]強調(diào)了合成外泌體在治療骨損傷及相關(guān)骨疾病方面的優(yōu)越性。一方面，外泌體通過內(nèi)吞、融合等多種不同方式介導(dǎo)其內(nèi)部的生物活性物質(zhì)進入靶細胞，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能；另一方面，外泌體與靶細胞結(jié)合方式的多樣性，使得其在治療骨損傷與骨疾病方面具有多種不同的使用方式，如藥物遞送劑、生物制劑等，從而在疾病的早期診斷及治療中發(fā)揮極大的優(yōu)勢。

Snx10作為調(diào)節(jié)細胞膜運輸?shù)姆诌x連接蛋白，定位于破骨細胞早期核內(nèi)體，具有調(diào)節(jié)細胞膜運輸?shù)墓δ?。Zhu等[29]發(fā)現(xiàn)沉默Snx10抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞形成和破骨細胞在羥基磷灰石上的吸收，也抑制TRAP的分泌，從而證實Snx10在破骨細胞中表達，且是體外破骨細胞分化及發(fā)揮活性所必需的。Battaglino等[30]通過酵母雙雜交篩選并鑒定了FKBP12，觀察到Snx10和FKBP12同早期核內(nèi)體抗原1 (EEA1)存在于蔗糖梯度離心得到的同一亞細胞組分中，表明FKBP12亦定位于早期核內(nèi)體，即Snx10和FKBP12作為合作伙伴，共同參與內(nèi)吞體/溶酶體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)可能為通過靶向破骨細胞膜轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵步驟來控制骨量丟失提供了新的治療方法。

Hu等[31]將CXCR4+外泌體與攜帶antagomiR-188的脂質(zhì)體融合，產(chǎn)生混合納米顆粒。檢測發(fā)現(xiàn)，雜交混合納米顆粒特異性聚集于骨髓，并通過釋放antagomiR-188從而促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨，抑制脂肪的生成，從而逆轉(zhuǎn)小鼠年齡相關(guān)性骨小梁丟失，發(fā)揮降低皮質(zhì)骨孔隙率的作用。miR-188隨年齡增長顯著升高，顯著促進骨髓間充質(zhì)干細胞成脂，抑制成骨。在老齡小鼠中，miR-188的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了與年齡相關(guān)的骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化的轉(zhuǎn)移，并改善了骨量丟失。本研究為構(gòu)建用于RNAi傳遞的骨靶向NPs作為老年骨量丟失的合成代謝治療提供了一種新策略。

陳逸青等[32]也進一步論述了外泌體在骨吸收及骨形成中的作用，并進一步提出外泌體在骨質(zhì)疏松癥的診斷、治療及預(yù)后方面的預(yù)測具有極高的應(yīng)用前景。但是，目前外泌體治療骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)研究主要還集中在動物實驗，鮮有實驗涉及到機體的干預(yù)及治療。未來，需要在進一步明確外泌體介導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥具體機制的前提下，進一步開展臨床試驗，從而真正達到外泌體治療骨疾病(骨質(zhì)疏松癥)的目標(biāo)。

4 展望

目前對于外泌體，已經(jīng)有了成熟可靠的檢測技術(shù)，外泌體中與疾病相關(guān)聯(lián)的microRNA的種類及其生物學(xué)功能檢測亦取得了極大地進展。然而，骨組織來源的microRNA在骨細胞間信息交流的具體機制還需要進一步研究。未來，將進一步明確外泌體中與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)聯(lián)的特異性microRNA在骨細胞間信息交流的具體機制及其作用于骨質(zhì)疏松癥的分子生物學(xué)機制，并以此為突破點，致力于骨質(zhì)疏松癥早期預(yù)防、早期診斷及抗骨質(zhì)疏松生物靶向藥物的研發(fā)。而某些特殊的血清外泌體蛋白質(zhì)組能否作為有效的骨質(zhì)疏松分子標(biāo)志物還需要進一步研究。

綜上所述，本文主要就外泌體在骨質(zhì)疏松癥方面的研究現(xiàn)狀進行了綜述。隨著研究方法的進步，也會有更多的外泌體被發(fā)現(xiàn)，其作用于骨質(zhì)疏松的具體機制也會更加深入，相信未來外泌體在骨質(zhì)疏松癥早期預(yù)防、早期診斷及抗骨質(zhì)疏松生物靶向藥物的研發(fā)方面會有極高的應(yīng)用價值，而這也正是未來研究的重點。