非編碼RNA在骨質(zhì)疏松癥預(yù)測和防治中的作用研究進(jìn)展

馬明領(lǐng) 董輝 楊斌 王永祥*

1.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 大連 116044

2.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇省蘇北人民醫(yī)院骨科，江蘇 揚(yáng)州 225001

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的主要特點為骨組織微結(jié)構(gòu)遭到破壞，骨小梁數(shù)量減少，骨脆性增加，在輕微外力作用下即可發(fā)生骨折[1]。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，其中女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和老年性骨質(zhì)疏松癥在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中較為多見。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥指繼發(fā)于某些其他疾病或服用某些藥物后引發(fā)的OP，比如糖尿病、甲亢、腎病等全身代謝性疾病或大量服用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物[2-3]。非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是指不能編碼蛋白質(zhì)、但卻具有極其重要的生物學(xué)功能的一類RNA。除轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)外，非編碼RNA主要還包括：相對分子量較小的RNA如微小RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)、核內(nèi)小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)等以及相對分子量較大的長鏈非編碼RNA(lncRNA)[4-5]。這些非編碼RNA的功能及表達(dá)水平的失調(diào)，可引起各種疾病，其中包括骨質(zhì)疏松癥[6]。近年來，越來越多的研究[7]表明非編碼RNA作為表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，能夠在基因?qū)用鎸P的發(fā)生發(fā)展起到調(diào)控作用。本文將主要對circRNA、lncRNA、miRNA和siRNA在OP診斷和防治中的應(yīng)用特點進(jìn)行綜述。

1 circRNAs與骨質(zhì)疏松癥

circRNA是非編碼RNA的一種，是新型共價閉合的環(huán)狀分子，數(shù)量較多且能夠在血液等體液中穩(wěn)定存在，不易被核糖核酸酶(RNase)降解，在組織表達(dá)中特異性高[8]；對細(xì)胞生長和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有著重要作用[9]。研究[10]證實circRNA可作為OP診斷的生物標(biāo)志物和治療靶點，在OP預(yù)測和防治中發(fā)揮著重要作用。

1.1 circRNAs與骨形成

研究[11]發(fā)現(xiàn) TNF-α通過抑制破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)源性外泌體中的circRNA-circHmbox1的表達(dá)，進(jìn)而抑制骨形成，circRNA-circHmbox1能夠靶向結(jié)合miRNA-1247-5P并抑制其表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)分化，促進(jìn)骨形成。Wang等[12]通過體外細(xì)胞和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)在糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(GIOP)中，hsa-circRNA-0006393出現(xiàn)低表達(dá)，證實hsa-circRNA-0006393作為miR-145-5P的海綿，可通過直接靶向抑制miR-145-5P和上調(diào)FOX01的表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。circFOXP1在OP患者中的表達(dá)水平與非OP患者相比顯著降低，circFOXP1被證明可作為miR-33a-5P的海綿，靶向結(jié)合miR-33a-5P并抑制miR-33a-5P的表達(dá)，從而增強(qiáng)人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(hASCs)的成骨分化能力[13]。Lin等[14]研究發(fā)現(xiàn) circ-SLC8A1在卵巢切除(OVX)小鼠中高表達(dá)，沉默circ-SLC8A1可增強(qiáng)miR-516b-5P的表達(dá)，circ-SLC8A1在胞質(zhì)中發(fā)揮競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNAs)的作用，通過阻斷miR-516b-5P對AKAP2表達(dá)的抑制作用，以此抑制骨形成。另外Wen等[15]發(fā)現(xiàn)circRNA-0076906可誘導(dǎo)hMSCs的成骨分化作用，circRNA-0076906可作為miR-1305的海綿，與miR-1305靶向結(jié)合并抑制miR-1305的表達(dá)，而miR-1305又能夠負(fù)向調(diào)控靶基因Osteoglycin(OGN)的表達(dá)，研究證實circRNA-0076906可通過miR-1305/OGN通路促進(jìn)hMSCs的成骨分化，從而延緩OP的進(jìn)展。

1.2 circRNAs與骨吸收

核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和集落刺激因子1(CSF1)在破骨細(xì)胞的分化成熟中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16-17]。Chen等[18]發(fā)現(xiàn)在RANKL+CSF1處理的骨髓巨噬細(xì)胞(BMM)中，circRNA-2831表達(dá)上調(diào)，體內(nèi)外circRNA-2831基因敲除后發(fā)現(xiàn)，BMM破骨細(xì)胞分化以及OVX小鼠骨吸收受到顯著抑制，研究表明circRNA-2831可作為ceRNA與miR-195a靶向結(jié)合，從而抑制miR-195a的表達(dá)，circRNA-2831/miR-195a/CSF1共同形成ceRNA網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控OC分化和骨吸收。另外Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)circRNA-0007059和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circRNA-0007059作為miR-378的海綿，能夠靶向作用于miR-378；且發(fā)現(xiàn)BMP2的3′-UTR有miR-378的結(jié)合靶點，miR-378與BMP2靶向結(jié)合并對其發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。circRNA對骨質(zhì)疏松的調(diào)控作用主要是其能夠作為miRNA的海綿，通過與miRNA靶向結(jié)合進(jìn)而調(diào)控miRNA的表達(dá)。同時circRNA能夠作為ceRNA,與miRNA、mRNA共同形成circRNA-miRNA-mRNA ceRNA網(wǎng)絡(luò)，從而使其能夠從基因?qū)用嬲{(diào)控骨形成與骨吸收。

2 lncRNAs與骨質(zhì)疏松癥

lncRNA由大于200個核苷酸組成，其在結(jié)構(gòu)上類似mRNA，但不具有編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能[20]。lncRNA自2002年首次被發(fā)現(xiàn)以來[21]，雖最初被認(rèn)為只是轉(zhuǎn)錄后的“副產(chǎn)物”，不具有生物學(xué)功能，甚至被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄中的“噪音”，但近年研究證實lncRNA在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞分化以及細(xì)胞周期等生命活動中發(fā)揮著重要作用[22]。lncRNA通過涉及miRNAs、mRNAs和蛋白質(zhì)的不同機(jī)制來執(zhí)行其功能[23-24]，在基因轉(zhuǎn)錄以及在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)水平上，參與包括OP在內(nèi)的機(jī)體疾病的發(fā)生與發(fā)展[25-26]。

2.1 lncRNAs與骨形成

研究[27]發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1能夠與miR-34a-5P競爭性結(jié)合，阻止其靶基因MURF2的降解，從而抑制去卵巢大鼠OB的分化和增殖，因此研究提出可通過沉默lncRNA CCAT1防治骨質(zhì)疏松癥。Yang等[28]發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3對骨代謝具有重要的調(diào)控作用，lncRNA MEG3能夠特異性地與miR-214結(jié)合，下調(diào)miR-214的表達(dá)，從而使TXNIP mRNA 表達(dá)上調(diào)，抑制OP大鼠成骨細(xì)胞分化、增殖能力，對骨質(zhì)疏松癥具有正性調(diào)控作用。Che等[29]對OP小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA HCG18表達(dá)增加，miR-30a-5P表達(dá)降低；而在BMSCs向OB分化過程中，HCG18表達(dá)顯著降低，miR-30a-5P表達(dá)顯著提高，HCG18基因敲除則可進(jìn)一步促進(jìn)miR-30a-5p表達(dá)，研究證實HCG18通過miR-30a-5p/NOTCH1軸抑制BMSCs成骨分化作用,進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，可見lncRNA HCG18可能是BMSCs成骨分化的調(diào)節(jié)因子。Yin等[30]研究表明lncRNA AK039312和AK079370均可與miR-199B-5P靶向結(jié)合，增強(qiáng)GSK-3β mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin通路，最終抑制OB分化和骨形成；miR-199B-5P作為OB分化的調(diào)節(jié)因子已被證實[31-32]，GSK-3β作為Wnt/β-catenin通路抑制劑，可使β-catenin磷酸化從而使其降解[33]。

2.2 lncRNAs與骨吸收

lncRNA參與成骨細(xì)胞分化、骨骼發(fā)育和骨骼疾病發(fā)生等過程[34-36]，然而關(guān)于lncRNA在體內(nèi)破骨細(xì)胞形成過程中的作用信息有限。Liu等[37]通過RNA測序(RNA-seq)鑒定lncRNA在破骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)1 117個lncRNA在OC中存在差異表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)的lncRNA 有699個，其余418個lncRNA表達(dá)下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)lncRNA ENSG00 000 257 764.2-miR-106a-5p-TIMP2構(gòu)成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)可能對于OC的分化成熟作用顯著。Li等[38]研究證實LncRNA H19能夠與miR-29a-3P靶向結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-10的表達(dá)，引起破骨細(xì)胞的增殖和凋亡，能夠參與OP的發(fā)生發(fā)展。Du等[39]研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL誘導(dǎo)的CD14+外周血單核細(xì)胞(PBMCs)向OC分化過程中，lncRNA TUG1表達(dá)顯著上調(diào)，且沉默TUG1表達(dá)發(fā)現(xiàn)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)陽性細(xì)胞數(shù)量減少、TRAP蛋白水平下降，而MafB蛋白水平增加，研究證實lncRNA TUG1在破骨細(xì)胞中過表達(dá)，并可與MafB靶向結(jié)合，對破骨細(xì)胞的成熟分化具有正向調(diào)節(jié)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA Nron對OC的形成具有調(diào)控作用，Nron的表達(dá)與破骨細(xì)胞的形成呈負(fù)相關(guān)，免疫熒光染色和Western blot結(jié)果證實，活化T細(xì)胞核因子1(NFATc1)蛋白可被Nron阻止進(jìn)入破骨細(xì)胞核，影響OC的分化，抑制OC的形成[40]。lncRNA在真核生物的多種組織中廣泛表達(dá)，其能夠調(diào)節(jié)多種生理和病理過程,可通過檢測血液或其他可獲取組織中的lncRNA表達(dá)水平的變化為骨質(zhì)疏松癥的早期診斷、治療及預(yù)后情況的評估提供一定的參考。

3 miRNAs與骨質(zhì)疏松癥

miRNA是一種分子量較小的單鏈非編碼RNA，約由20～25個核苷酸組成。miRNA作為表觀遺傳調(diào)控因子，能夠與mRNA的3’-UTR靶向結(jié)合，具有選擇性的抑制、切割、降解內(nèi)源性mRNA的作用，最終抑制靶基因的翻譯，改變其生物活性[41-42]。miRNA存在于各種生物中，可在基因?qū)用嬲{(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程[43]。miRNA可以對機(jī)體中超過50 %的蛋白編碼基因進(jìn)行調(diào)控[44]。

3.1 miRNAs與骨形成

最新一項研究[45]對120名絕經(jīng)后女性進(jìn)行基因檢測后發(fā)現(xiàn)OP組miR-206表達(dá)水平顯著低于正常對照組，并且miR-206在OP患者中的表達(dá)水平與骨密度(bone mineral density BMD)呈正相關(guān)，miR-206與組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)靶向結(jié)合調(diào)控OB的增殖、凋亡，影響骨形成，參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。Li等[46]在小鼠原代OB中發(fā)現(xiàn)miR-2861，它被認(rèn)為是一種新的miRNA，能夠靶向抑制HDAC5表達(dá)，促進(jìn)骨形成；抑制miR-2861的表達(dá)后BMP2的表達(dá)隨之下降，而過表達(dá)miR-2861則會增強(qiáng)BMP2誘導(dǎo)的骨形成過程，可見miR-2861在骨形成過程中發(fā)揮著正向調(diào)控作用。Sun等[47]研究發(fā)現(xiàn)，miR-103-3p可通過直接靶向抑制m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL4抑制骨形成，在OVX小鼠中治療性的抑制miR-103-3P的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)骨形成減少，表明miR-103-3P/METTL14/m6A信號軸能夠有效調(diào)控骨形成過程。Wu等[48]發(fā)現(xiàn)miR-199a-3P通過與Kdm3a靶向結(jié)合并負(fù)向調(diào)控Kdm3a的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞分化，而Kdm3a能夠促進(jìn)Erk2和Klf2 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Klf2能夠增強(qiáng)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的自我更新能力，促進(jìn)組織器官再生，Klf2通過與Runx2靶向結(jié)合在成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮生理功能，當(dāng)抑制Klf2的表達(dá)會對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞產(chǎn)生相反的效應(yīng)，前者分化能力減弱，后者分化能力增強(qiáng)[49-51]。

3.2 miRNAs與骨吸收

研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可通過促進(jìn)或抑制破骨細(xì)胞的分化來調(diào)控骨質(zhì)疏松。Shen等[52]研究發(fā)現(xiàn)miR-128水平與OVX小鼠/PMOP患者骨標(biāo)本和OVX小鼠原代BMMs中NFATc1水平升高呈正相關(guān)，而去乙?；? (SIRT1)是miR-128在OC分化過程中轉(zhuǎn)錄后水平的直接靶點，SIRT1水平的升高可抑制TNF-α和IL-1的表達(dá)，從而降低NF-κB的活性，在BMMs中過表達(dá)或抑制miR-128發(fā)現(xiàn)OC的生成顯著增加或減少，OC中miR-128的缺失能夠顯著抑制OVX觸發(fā)的OC生成，并對小鼠骨丟失起到保護(hù)作用，研究揭示了由miR-128/SIRT1/NF-κB信號軸介導(dǎo)的OC發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制，為PMOP的診斷和治療提供了可能的途徑。研究表明在OC介導(dǎo)的骨吸收過程中，RANKL、骨保護(hù)素(OPG)和CXCL12發(fā)揮著重要調(diào)控作用[53-54]。Lian等[55]發(fā)現(xiàn) miR-29a通過調(diào)節(jié)RANKL和趨化因子CXCL12，抑制OC形成，miR-29a通過與RANKL靶向結(jié)合，抑制成骨細(xì)胞RANKL的分泌，從而有助于阻止OP的進(jìn)展。另外Mizoguchi等[56]發(fā)現(xiàn)在RANKL刺激下，BMM的miR-31表達(dá)顯著增強(qiáng)，當(dāng)抑制miR-31表達(dá)時，RANKL誘導(dǎo)的OC形成和骨吸收作用也受到抑制，研究發(fā)現(xiàn)miR-31主要是通過靶向結(jié)合RhoA并抑制其表達(dá)從而調(diào)控OC分化，進(jìn)而調(diào)控骨吸收。miRNA作為表觀遺傳調(diào)控因子主要通過調(diào)控下游mRNA的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成或破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，可針對miRNA的作用通路、miRNA的結(jié)合靶點或者對miRNA本身表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控來阻止骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。

4 siRNAs與骨質(zhì)疏松癥

siRNA是由21～25個核苷酸組成的雙鏈RNA分子[57]，是由進(jìn)入細(xì)胞后的雙鏈RNA(dsRNA)被RNaseⅢ家族中的Dicer切割形成[58]。目前siRNA主要通過RNA干擾技術(shù)(RNAi)應(yīng)用于疾病的防治。RNAi 技術(shù)的原理主要是利用雙鏈 RNA降解細(xì)胞內(nèi)同源信使RNA(mRNA)，從而阻斷特定基因表達(dá)[59-60]。siRNA需要與解旋酶、核酸內(nèi)切酶等形成RNA介導(dǎo)的靜默復(fù)合物(RISC),且需要被RISC中的解旋酶解開成兩條單鏈，其中一條單鏈為反義鏈與同源mRNA特異結(jié)合，使mRNA沉默或降解[61]。siRNA所具有的理化特點(帶有負(fù)電荷、相對分子質(zhì)量大、不穩(wěn)定)決定siRNA需要與載體相結(jié)合才能被運(yùn)送至靶細(xì)胞，目前siRNA主要與病毒載體或非病毒載體結(jié)合, 進(jìn)行細(xì)胞感染或轉(zhuǎn)染，從而對特定基因進(jìn)行調(diào)控[62]。

原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src參與多種細(xì)胞功能，有研究證實Src抑制OB分化，降低Src的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)OB分化增強(qiáng)，骨形成能力增加；同時Src也可以通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨架，提高OC分化能力，促進(jìn)骨吸收[63-67]。Zheng等[68]建立類固醇相關(guān)性骨壞死(SAON)兔模型,之后將Src-siRNA、對照siRNA和生理鹽水髓內(nèi)注射到股骨近端，誘導(dǎo)6周后通過顯微CT和組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，對照組兔的股骨頭干骺端出現(xiàn)明顯的骨丟失，而注射了Src-siRNA的兔模型發(fā)現(xiàn)骨表面侵蝕減少，OC介導(dǎo)的骨吸收減少，證實siRNA敲除Src可減少骨吸收。Sezlev等[69]以陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)為復(fù)合材料制備聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)納米膠囊，將PEI:RANK siRNA復(fù)合物裝載至PLGA納米膠囊，并將其轉(zhuǎn)入小鼠巨噬細(xì)胞破骨前體細(xì)胞系RAW264.7，發(fā)現(xiàn)破骨前體細(xì)胞中的RANKL mRNA表達(dá)降低，并且研究結(jié)果顯示OC分化受到抑制，分化后的OC破骨活性降低，成熟OC的抗氧化活性明顯降低；此研究表明PEI:RANK siRNA復(fù)合物包裹在納米級PLGA膠囊中，有可能作為一種新的替代方法系統(tǒng)性地治療骨質(zhì)疏松癥。CKIP-1是骨形成的負(fù)性調(diào)控因子，參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[70]；Guo等[71]在體外篩選并鑒定了一個在人、恒河猴、大鼠和小鼠中具有高敲除效率的CKIP-1 siRNA序列即kipp-1 siRNA序列，通過實驗證實kipp-1 siRNA序列可促進(jìn)體外跨物種成骨分化，促進(jìn)健康小鼠骨形成，阻止骨吸收。

5 結(jié)語和展望

目前臨床對OP缺乏有效的預(yù)測和防控手段，針對OP的治療藥物主要是雙膦酸鹽類、降鈣素類、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERMs)、性激素補(bǔ)充劑、甲狀旁腺素類似物(PTHa)、氟化物、鍶鹽、中藥和中成藥以及近期在國內(nèi)批準(zhǔn)上市的地舒單抗(Denosumab)等藥物，目前以上治療藥物尚不能徹底預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。非編碼RNA如circRNA、lncRNA、miRNA等能夠穩(wěn)定地存在于血液等體液中，獲取及檢測方便。相信隨著研究的更加深入，非編碼RNA能夠作為OP預(yù)測、診斷的生物標(biāo)志物及治療的新靶點，在OP的防治中得到有效的應(yīng)用。