AM真菌結(jié)構(gòu)及鑒定方法的研究進(jìn)展

楊帆 曹涵銘 陳園園 王金龍

摘要? ? 叢枝菌根（AM）真菌是在自然界中廣泛分布于土壤的有益微生物。AM真菌鑒定是菌根研究的基礎(chǔ)，其對(duì)保護(hù)菌種多樣性，促進(jìn)AM真菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用具有重要意義。本文總結(jié)了AM真菌的結(jié)構(gòu)特征、國(guó)內(nèi)外在其形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定方法，旨在為AM真菌的多樣性調(diào)查和更加精準(zhǔn)地開(kāi)展AM真菌鑒定工作提供參考。

關(guān)鍵詞? ? 叢枝菌根（AM）真菌;多樣性;結(jié)構(gòu);鑒定方法

中圖分類(lèi)號(hào)? ? S154.3? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）16-0152-03? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? Arbuscular mycorrhizal（AM） fungi are beneficial microorganisms that widely distribut in the soil in nature. Identification of AM fungi is the basis of mycorrhiza research，and it is of great significance to protect the diversity of strains and promote the application of AM fungi in agricultural production. This paper summarized the structural characteristics of AM fungi，and its morphological and molecular biology methods at home and abroad，in order to provide reference investigation for the diversity of AM fungi and more accurate identification of AM fungi.

Key words? ? arbusular mycorrhizal fungi;diversity;structure;identification method

我國(guó)自然資源豐富，植物種類(lèi)多樣。叢枝菌根（AM）真菌能與包括被子植物、裸子植物、苔蘚、地衣[1]以及已發(fā)現(xiàn)的90%的維管束植物形成共生體，并影響其生長(zhǎng)發(fā)育。因此，AM真菌是一種寶貴的微生物資源，AM真菌的菌絲體在細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)是泡囊狀和叢枝狀，所以AM真菌又被稱(chēng)為泡囊-叢枝菌根，即VA菌根[2]。

叢枝菌根真菌是一種普遍存在于自然生態(tài)系統(tǒng)與農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的真菌，能與大多數(shù)陸生植物根系形成互惠共生體系的微生物。AM真菌具有專(zhuān)性活體營(yíng)養(yǎng)的特性，目前還不能進(jìn)行分離提純培養(yǎng)，其寄生對(duì)宿主沒(méi)有特異性選擇[3]，只進(jìn)行無(wú)性繁殖。

1? ? AM真菌的功能及結(jié)構(gòu)

1.1? ? AM真菌的功能

菌根是土壤中的菌根真菌與寄主植物營(yíng)養(yǎng)根系相結(jié)合形成的互惠共生體，和菌根共同形成的真菌稱(chēng)為菌根真菌。這種共生現(xiàn)象是寄主植物將自身光合同化的有機(jī)物或碳水化合物供給自身生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)還提供給菌根真菌生長(zhǎng);此外，菌根真菌的菌絲體交叉生長(zhǎng)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，大面積地接觸寄主植物根系周?chē)耐寥?，有助于吸收土壤中更多的養(yǎng)分，增強(qiáng)了寄主植物根系對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和水分的吸收[4]。AM真菌的功能主要受以下3個(gè)因素的影響，分別為菌絲在土壤中的密度、活性及其分布狀態(tài)[5]。

除了十字花科、蓼科、莎草科、莧科、石竹科等10余科植物外[6]，叢枝菌根真菌幾乎能和所有的綠肥作物、果樹(shù)、蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物形成互惠共生體[2]。研究初期關(guān)于陸地生態(tài)環(huán)境的特征表明，水生低等植物向陸生高等植物進(jìn)化的過(guò)程，AM真菌的作用是必不可少的;在惡劣的生態(tài)環(huán)境中，菌根植物則是發(fā)展的重點(diǎn)，非菌根植物的存活率極低[6]。

AM真菌功能具有多樣性，主要體現(xiàn)在以下8個(gè)方面：①植物根系土壤周?chē)泻芏嗖荒鼙恢参镂盏牡V質(zhì)元素，植物不能得到足夠的營(yíng)養(yǎng)，而AM真菌可以有效獲取并利用土壤中移動(dòng)性差的元素，幫助植物有效吸收利用;②土壤中的微生物存在很多傳染性病原，單一的植株很難抵抗這些病原物，而AM真菌能有效抵抗病原微生物的傳播，因而接種了AM真菌的植株抵抗土壤中傳染性病原微生物的能力有所提高;③提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性，如干旱、鹽漬、重金屬毒害等;④與根際微生物協(xié)同促進(jìn)植物固氮、或加速土壤中氮磷化合物或有機(jī)污染物的形態(tài)轉(zhuǎn)化;⑤AM真菌能提升生態(tài)系統(tǒng)凈生產(chǎn)力的主要原因是自身合成球囊霉或相關(guān)蛋白;⑥AM真菌通過(guò)菌絲直接纏繞土壤以及菌絲分泌的其他物質(zhì)對(duì)土壤的黏結(jié)，促進(jìn)土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體的形成，參與了土壤演變過(guò)程;⑦作物群落的生物多樣性、群落的穩(wěn)定性的相關(guān)變化，歸結(jié)于A(yíng)M真菌與植物群落相互作用的程度，是否直接與群落產(chǎn)生作用;⑧不同群落的植物被地下的菌絲網(wǎng)絡(luò)侵染，將會(huì)形成一個(gè)龐大的菌落，不再出現(xiàn)單一植株，同時(shí)通過(guò)菌絲網(wǎng)絡(luò)傳遞植物間所需的營(yíng)養(yǎng)成分[7]。因此，AM真菌可以作為植物的生物肥料、生物防護(hù)劑、生物農(nóng)藥、生物促進(jìn)劑等[8-10]，其在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用性很強(qiáng)并且有廣闊的前景。

1.2? ? AM真菌的結(jié)構(gòu)及作用

根據(jù)菌根菌絲與寄主植物根細(xì)胞的關(guān)系，科學(xué)家將其分為外生菌根、內(nèi)生菌根和內(nèi)外兼生菌根。外生菌根是指菌根菌絲只會(huì)侵入到幼嫩寄主植物根細(xì)胞的皮層，不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞侵染，在細(xì)胞的間隙形成一種哈蒂氏網(wǎng)，根外形成菌套;內(nèi)生菌根是菌根菌絲會(huì)透過(guò)寄主植物根的細(xì)胞壁，進(jìn)入到表皮或根部皮層細(xì)胞進(jìn)行侵染，長(zhǎng)在細(xì)胞間隙的菌絲[11]形成叢枝狀的分枝，叢枝菌根是內(nèi)生菌根中沒(méi)有隔膜的一類(lèi)[3];內(nèi)外兼生菌絲則兼顧了內(nèi)生菌根和外生菌根的形態(tài)特征以及生理特性。由圖1可知，叢枝菌根包括泡囊、叢枝、胞間菌絲等結(jié)構(gòu)[12]。

1.2.1? ? 根外菌絲。菌根真菌的根外菌絲是分布在土壤基質(zhì)中的真菌菌絲體，其菌絲體在寄主植物根外分枝伸展，發(fā)達(dá)時(shí)可在植株根際周邊形成松散的菌絲網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。根據(jù)菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為2類(lèi)，一類(lèi)是厚壁菌絲，細(xì)胞壁厚且菌絲不分隔，多核，直徑20～30 μm;另一類(lèi)是薄壁菌絲，起源于厚壁菌絲的棱角狀突起，直徑2～7 μm，能穿透土壤中有機(jī)物顆粒吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分[6]。

1.2.2? ? 根內(nèi)菌絲。根部細(xì)胞內(nèi)部的菌絲稱(chēng)為根內(nèi)菌絲，可分為胞內(nèi)菌絲和胞間菌絲。胞內(nèi)菌絲就是指菌絲從一個(gè)細(xì)胞直接進(jìn)入另一個(gè)細(xì)胞體內(nèi)沿著根系縱向生長(zhǎng)的一類(lèi)菌絲體。胞間菌絲指生長(zhǎng)在細(xì)胞間隙的菌絲，在叢枝菌根真菌侵染植物根系時(shí)可以經(jīng)?？吹絒3]。

1.2.3? ? 侵入點(diǎn)。侵入點(diǎn)是叢枝菌根真菌菌絲穿透并侵入根內(nèi)的位點(diǎn)。當(dāng)菌絲與根表皮接觸時(shí)，根表皮就會(huì)形成一個(gè)類(lèi)似附著胞的結(jié)構(gòu)，是菌絲進(jìn)入根系內(nèi)的通道。一般來(lái)說(shuō)，每毫米根系侵入點(diǎn)的數(shù)量是1～25個(gè)，其數(shù)量主要取決于植物種類(lèi)、真菌種類(lèi)及土壤特性的差異。因此，單位根系長(zhǎng)度侵入點(diǎn)的數(shù)量可作為評(píng)價(jià)叢枝菌根真菌侵染程度大小的指標(biāo)之一[3]。

1.2.4? ? 叢枝。叢枝是菌根菌絲侵入寄主植物根細(xì)胞后，連續(xù)快速分枝形成的一種枝狀結(jié)構(gòu)。一般來(lái)說(shuō)，叢枝出現(xiàn)在菌根侵染初期階段，維持2～3周后重新消亡或分枝。含有叢枝的細(xì)胞內(nèi)有大量小液泡，其中有許多0.1～0.2 μm的聚磷酸鹽。叢枝是養(yǎng)分吸收和交換的重要場(chǎng)所[13]，叢枝的豐富度與產(chǎn)生速率，被作為體現(xiàn)菌根共生體中功能菌根的數(shù)量及真菌的代謝和功能潛力的標(biāo)志[14]。

1.2.5? ? 泡囊。泡囊多為圓形、橢圓形或方形囊狀結(jié)構(gòu)，由宿主皮層細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)菌絲末端或中部膨大而成。不同的叢枝菌根真菌具有不同的泡囊形態(tài)。Glomus真菌的泡囊一般是橢圓形且無(wú)梗的，而Acaulospora、Entrophospora和Kuklo-spora真菌的泡囊與之不同，后者表面常有凹陷[15]。并非所有AM真菌都產(chǎn)生大量泡囊，Archaeospora、Intraspora、Paraglo-mus和Scutellospora極少形成泡囊。所以泡囊是AM真菌形態(tài)學(xué)鑒定指標(biāo)之一。泡囊的功能一是貯藏養(yǎng)分，其內(nèi)貯藏大量油狀內(nèi)含物，是貯藏器官;二是隨受損組織進(jìn)入土中起繁殖體的作用[6，11]。

1.2.6? ? 孢子和孢子果。孢子和孢子果是叢枝菌根真菌繁殖的重要器官，著生在根外菌絲上，分布于土壤中，一般為圓形或橢圓形，內(nèi)含儲(chǔ)藏性脂肪和碳水化合物[13]。孢子和孢子果的大小、形狀、顏色以及胞壁的結(jié)構(gòu)是菌根分類(lèi)學(xué)的重要依據(jù)之一。

2? ? AM真菌的分類(lèi)

1885年德國(guó)植物生理學(xué)家森林學(xué)家Frank首次提出“菌根”。AM真菌的多樣性主要表現(xiàn)在分子水平、形態(tài)學(xué)水平和生態(tài)學(xué)水平上[5]。國(guó)際叢枝菌根保藏中心做了大量工作，并對(duì)Morton和Benny的分類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)行修正[16]。歐洲菌藏中心（BEG）已登記保藏了10科多屬種菌株，并保藏了部分菌種的基因序列，為AM真菌的形態(tài)學(xué)鑒定提供了重要的檢索對(duì)照依據(jù)[17]。目前，共有1個(gè)綱，4個(gè)目，8個(gè)科，10個(gè)屬（表1）[18]。

據(jù)估計(jì)，AM真菌已經(jīng)在世界存在逾4.6億年，Schü？覻ler等[19-20]對(duì)AM真菌的18S rDNA基因進(jìn)行分析后，結(jié)果顯示，AM真菌與接合菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)以及子囊菌門(mén)有共同的起源[21]，所以科學(xué)家將AM真菌歸屬為球囊菌門(mén)（Glomer-omycota），AM真菌屬于球囊菌門(mén)、球囊菌綱，目前已分離鑒定了200余種[22]。

3? ? AM真菌的鑒定方法

3.1? ? 形態(tài)學(xué)鑒定方法

AM真菌形態(tài)學(xué)的鑒定主要觀(guān)察以下3個(gè)特征：孢子、孢子果以及孢子壁的各個(gè)形態(tài)，但孢子及孢子果主要依附于被侵染物根系周?chē)耐寥乐小?/p>

特定種類(lèi)的染色劑如Melzer試劑、棉藍(lán)試劑可與部分AM真菌孢子壁層發(fā)生特異性反應(yīng)，真菌種類(lèi)不同反應(yīng)特征也不同，因而這種通過(guò)觀(guān)察反應(yīng)差異的形態(tài)學(xué)鑒定方法可作為AM真菌鑒定的輔助方法。通過(guò)濕篩傾析法從土壤中篩選出一些孢子，觀(guān)察（體式顯微鏡）其生長(zhǎng)發(fā)育基本特征、孢子聚集方式、孢子果內(nèi)的排列方式，然后通過(guò)Olympus顯微鏡觀(guān)察測(cè)定孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分類(lèi)鑒定[23]。

3.2? ? 分子生物學(xué)鑒定方法

AM真菌的分子生物學(xué)鑒定主要根據(jù)不同類(lèi)的核糖體DNA排列順序不同，得到特異引物來(lái)對(duì)AM真菌做到基因水平的精確分類(lèi)。DNA提取一般采用CTAB法。由于PCR技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、速度快，可以較全面地建立AM真菌的DNA克隆文庫(kù)。

rDNA具有高度保守性，根據(jù)這一特性可設(shè)計(jì)完成具有種間高度特異性的PCR引物[3]。高等級(jí)水平生物群體間的系統(tǒng)分析可利用18S、5.8S和28S rDNA基因組成的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元[24]，該轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）。ITS的特點(diǎn)為在A(yíng)M真菌種間表現(xiàn)多種變異，而在同種不同株間表現(xiàn)高度保守性，這一特性可為AM真菌的分類(lèi)鑒定提供豐富的遺傳信息[25]。18S rRNA基因克隆文庫(kù)構(gòu)建是目前研究AM真菌多樣性較為理想的方法，該基因克隆庫(kù)的構(gòu)建可以準(zhǔn)確地揭示土壤環(huán)境、植物根系的AM真菌多樣性。目前常用檢測(cè)AM真菌多樣性的方法如下。

3.2.1? ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是PCR技術(shù)依賴(lài)DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下進(jìn)行，其特異性由根據(jù)rDNA設(shè)計(jì)的引物和模板DNA的特異性結(jié)合決定，因?yàn)閞DNA在同源物種的進(jìn)化上是高度保守的，而間隔區(qū)序列存在種間差異[3]?？蓮腁M真菌孢子中提取DNA，用PCR擴(kuò)增，根據(jù)DNA模板和引物結(jié)合的特異性，通過(guò)電泳擴(kuò)增分離片段，比較不同AM真菌擴(kuò)增產(chǎn)物的差異[26]。

3.2.2? ? 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）是利用一種隨機(jī)合成的隨機(jī)排列的單寡核苷酸引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增靶細(xì)胞DNA。不同菌株間的基因組可能存在重組、插入或缺失導(dǎo)致的基因序列的改變，擴(kuò)增的產(chǎn)物通過(guò)電泳分析獲得電泳圖譜，進(jìn)而分析DNA片段數(shù)量和長(zhǎng)度的多態(tài)性。RAPD使用的是隨機(jī)引物，不用提前知道目的基因及其相應(yīng)的序列，但這可能導(dǎo)致生物個(gè)體某一特殊DNA片段得不到有效擴(kuò)增[27];RAPD操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)周期短，能在較短時(shí)間內(nèi)篩選大量樣品;RAPD標(biāo)記可以覆蓋包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)整個(gè)基因組，反映整個(gè)基因組的變化[3]，是一項(xiàng)很有價(jià)值的分子標(biāo)記技術(shù)。

3.2.3? ? 變性梯度凝膠電泳（DGGE）。變性梯度凝膠電泳（DGGE）是對(duì)16S rDNA基因上不同序列的DNA解旋所需的不同變性劑的溫度和濃度，可分離某一個(gè)不同堿基的雙鏈DNA片段的分子電泳技術(shù)[28]。分子生物學(xué)鑒定中，能快速分離鑒定大量樣品，既可以分析不同微生物群落的差異，也可以研究同一個(gè)微生物群落隨時(shí)間和外部環(huán)境壓力的變化過(guò)程[29]，但是DGGE圖譜只顯示群落豐富度，不能確定具體AM真菌菌種。

3.2.4? ? 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）是一種利用放射性同位素標(biāo)記或非放射性同位素標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移在固相膜上的基因組DNA進(jìn)行雜交，得到不同多態(tài)性的限制性消化片段以用來(lái)分析DNA[30]。根據(jù)被AM真菌侵染的寄主根系的ITS序列和18S rRNA基因片段設(shè)計(jì)特定引物，PCR和RFLP可用于鑒定AM真菌[30]。可分析編碼特定基因的基因區(qū)域，也可用來(lái)鑒定種群內(nèi)和種群間各個(gè)體的差異[31]。RFLP建立在PCR基礎(chǔ)上，所以不用分離培養(yǎng)，而且該法可檢測(cè)到環(huán)境中所有的菌，包括活菌（可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的）和未降解的死菌[32]。在研究夏季洪水對(duì)AM真菌數(shù)量的影響時(shí)，用ITS-RFLP技術(shù)分析AM真菌孢子的基因組特征[33]。相關(guān)學(xué)者[34]用ITS-PCR/RFLP技術(shù)分析了AM真菌結(jié)構(gòu)的多樣性。RFLP是一種對(duì)DNA序列分析的簡(jiǎn)化，可進(jìn)行親緣關(guān)系較近的鑒定。

3.2.5? ? 磷酸脂肪酸（AFLP）測(cè)定技術(shù)。磷酸脂肪酸（AFLP）測(cè)定技術(shù)是一項(xiàng)基于PCR和RFLP相結(jié)合的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)根據(jù)磷脂脂肪酸分子的結(jié)構(gòu)不同，選擇擴(kuò)增基因組DNA限制性酶切片段，可進(jìn)行特異性分子標(biāo)記。RFLA對(duì)內(nèi)切酶要求高，用量少，沒(méi)有復(fù)等位基因，靈敏度高，但操作要求嚴(yán)格，擴(kuò)散時(shí)多發(fā)假陽(yáng)性、凝膠背景雜亂等諸多問(wèn)題，使該技術(shù)在一定程度上存在局限性[17]。

3.2.6? ? 高通量測(cè)序技術(shù)。高通量測(cè)序技術(shù)是利用芯片進(jìn)行測(cè)序，可以在數(shù)百萬(wàn)個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測(cè)序。此外，因?yàn)闃悠分心撤NDNA被測(cè)序的次數(shù)反映了樣品中該DNA的豐富度，所以有精確的定量功能[35]。高通量測(cè)序技術(shù)能更準(zhǔn)確地揭示微生物群落、多樣性及生物地理學(xué)的變化[36]，極大地降低了測(cè)序成本，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模土壤微生物的直接測(cè)序[37]。

3.3? ? 2種方法的優(yōu)缺點(diǎn)

形態(tài)學(xué)鑒定有不一致性、局限性和偶然性[5]，基本只能鑒定到種，更多的取決于鑒定者經(jīng)驗(yàn)，容易丟失不產(chǎn)生孢子的種類(lèi)。這需要鑒定者對(duì)已發(fā)現(xiàn)真菌以及新紀(jì)錄種的形態(tài)特征有足夠的了解[17]。同時(shí)，有些孢子形態(tài)又極其相似，很難客觀(guān)全面地對(duì)AM真菌做出評(píng)價(jià)，低估了 AM真菌物種多樣性，又因?yàn)锳M真菌孢子易受環(huán)境影響，在特定季節(jié)或環(huán)境下，某些產(chǎn)生孢子多的AM真菌可能會(huì)被認(rèn)為是優(yōu)勢(shì)種，但當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)他們可能會(huì)停止產(chǎn)生孢子[36]。

雖然分子生物學(xué)可以克服這一局限，但也存在自身局限性。分子生物學(xué)方法鑒定在DNA提取時(shí)，易受微生物區(qū)系、真菌結(jié)構(gòu)以及生育期的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，而且檢測(cè)樣本來(lái)源于田間，非無(wú)菌培養(yǎng)，真菌DNA在擴(kuò)增過(guò)程中易被污染[38]。目前，分子生物學(xué)方法鑒定更有科學(xué)性，但仍需不斷完善。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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