可樂(lè)碳量子點(diǎn)的提取及其抑菌性研究

陳巧玲，陳碧桑，李飛明，游雨婷，吳秀婷

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州 363000）（2.閩南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，福建漳州 363000）（3.廈門大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，福建廈門 361005）

碳量子點(diǎn)由碳元素構(gòu)成，而碳元素是生命體最重要的組成元素之一，生命體基本結(jié)構(gòu)物質(zhì)的主要骨架如氨基酸和核苷酸等都是由碳元素組成的。因此，由碳元素構(gòu)成的量子點(diǎn)是一類生物毒性低的半導(dǎo)體納米顆粒。近年來(lái)，因碳量子點(diǎn)（CDs）具有良好的生物相容性，穩(wěn)定的熒光特性，抗光漂白以及激發(fā)熒光發(fā)射等特性，大大的吸引了研究學(xué)者的興趣[1,2]。此外，因CDs表面富含多種官能團(tuán)如：羧基、羥基和羰基等，這些基團(tuán)不僅可以作為CDs參與化學(xué)反應(yīng)的位點(diǎn)，而且也通過(guò)這些位點(diǎn)對(duì)CDs進(jìn)行修飾，從而使它具有一定的化學(xué)特性[3,4]?；谶@些特性，CDs可用于傳感器[5,6]、光催化[7]、敏化劑[8]、生物成像[9～11]、白光發(fā)光二極管[3,12]、藥物或者基因載體[13]等領(lǐng)域。因此，如何通過(guò)簡(jiǎn)單、綠色、高效的方法制備無(wú)毒、粒徑、形貌均一的高質(zhì)量的CDs，并研究它的性質(zhì)依然是個(gè)重要的課題。

迄今為止，CDs合成主要有兩種方法：自上而下以及自下而上。典型的自上而下方法有電弧放電法[14]、激光剝蝕法[15]、電化學(xué)法[7]和水熱處理法[16]等合成方法。自下而上的方法主要將小分子碳通過(guò)化學(xué)手段合成碳量子點(diǎn)。主要有化學(xué)氧化法[17]、高溫?zé)峤夥╗18]和微波法[19]等。碳量子點(diǎn)迄今為止多為合成，且每種方法均各有優(yōu)缺點(diǎn)，不經(jīng)化學(xué)反應(yīng)直接獲取碳量子點(diǎn)的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。本文開創(chuàng)了一種以可樂(lè)為原材料通過(guò)透析直接獲得碳量子點(diǎn)的方法，與傳統(tǒng)合成方法相比，所得的碳量子點(diǎn)表面富含羥基、羧基等官能團(tuán)，具有良好的單分散性、溶解度高、容易進(jìn)行后續(xù)改性和應(yīng)用。本文還重點(diǎn)探索了CDs材料對(duì)多種菌的抑制作用，以期更直觀的觀察其細(xì)胞毒性。從可樂(lè)中提取CDs步驟簡(jiǎn)單，無(wú)毒，原料易得無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備及實(shí)驗(yàn)技巧，可以隨時(shí)隨地制備碳量子點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

紫外分光光度計(jì)（島津UV-2550）；熒光分光光度計(jì)（Varian Cary Eclipse，Ex slit 5 nm，Em slit 5 nm）；紅外光譜儀（Thermo Fisher 6700）；透射電鏡（FEI Tecnai-G2-F30 Transmission）；HH-6恒溫水浴鍋（金壇市鴻科儀器廠）；E240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；pHS-3B酸度計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；YXQ-LS-75G滅菌鍋（上海博訊）；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）；ZWY-240旋轉(zhuǎn)搖床（上海智城）；ALPHA1-2 LD-PLUS凍干機(jī)（德國(guó)CHRIST）。

1.1.2 培養(yǎng)基與供試菌種

（1）實(shí)驗(yàn)用水為超純水18.2 MΩ（MILLIPORE），去離子水（MILLIPORE），可口可樂(lè)（購(gòu)買于漳州市新華都超市），1 ku透析膜（美國(guó)進(jìn)口，聯(lián)合碳化），75%酒精（西隴化工）。

（2）培養(yǎng)基(廠家均為北京路橋)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂(蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min)、LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、pH 7.0，121 ℃滅菌15 min)、普通肉湯(蛋白胨20 g、牛肉粉5 g、氯化鈉5 g、pH 7.5±0.1，121 ℃滅菌15 min)、10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯(胰蛋白胨17 g、大豆蛋白胨3 g、氯化鈉100 g、磷酸氫二鉀2.5 g、葡萄糖2.5 g、丙酮酸鈉10 g、pH 7.3±0.2，121 ℃滅菌15 min)、察氏液體培養(yǎng)基(硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、蒸餾水1000 mL、pH 6.8±0.2，121 ℃滅菌15 min)、察氏固體培養(yǎng)基(硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g蒸餾水1000 mL、pH 6.8±0.2，121 ℃滅菌15 min)、馬鈴薯培養(yǎng)基(馬鈴薯粉6.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1000 mL、pH 5.6±0.2，121 ℃滅菌15 min)。

（3）菌種（廣東省微生物菌種保藏中心）：GIM 1.559大腸桿菌(Escherichia coli)、GIM 1.221金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、GIM 2.194白色念珠菌(Candida albicans)、GIM 1.977枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、GIM 1.843銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

1.2 可樂(lè)碳量子點(diǎn)的提取

將1.25 L可口可樂(lè)通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至100 mL左右，采用1 ku透析膜透析24 h，其中每隔約3 h更換一次蒸餾水，直至透析結(jié)束，將透析袋內(nèi)溶液再次濃縮至約50 mL經(jīng)凍干機(jī)凍干為碳量子點(diǎn)。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

將提取所得碳量子點(diǎn)采用透射電鏡掃描、熒光分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)和紅外光譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1 菌種活化及菌液制備

將冷凍保存的菌種與100 mL各菌種所需的液體培養(yǎng)基進(jìn)行混合，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)各菌液濃度。

其中，大腸桿菌液體培養(yǎng)基使用普通肉湯培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌液體培養(yǎng)基使用10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯，固體培養(yǎng)基使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂；白色念珠菌液體培養(yǎng)基使用改良馬丁液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基使用改良馬丁固體培養(yǎng)基；枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基使用普通肉湯培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂；銅綠假單胞菌液體培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

1.4.2 預(yù)加菌液法倒平板

分別將1 mL供試指示菌菌液注入已冷卻至50 ℃左右的培養(yǎng)基中，混勻，倒約20 mL/平板，水平靜置凝固后備用。制得1×106CFU/mL備用。

1.4.3 抑菌材料試驗(yàn)濃度

將碳量子點(diǎn)配制成2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、500 mg/L和1000 mg/L等濃度進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.4 打孔法抑菌圈試驗(yàn)

打孔法：用已滅菌的打孔器在試驗(yàn)平板上打孔，小心挑去培養(yǎng)基小塊以做成6 mm左右圓孔，往孔中注入80 μL各種濃度的碳量子點(diǎn)溶液，4 ℃預(yù)擴(kuò)散2 h，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈大小。

1.4.5 抑菌圈大小測(cè)量

用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，以表示抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 電鏡掃描、紫外、紅外及熒光光譜

圖1 電鏡下碳量子點(diǎn)形態(tài)Fig.1 TEM image of CDs

圖2 可樂(lè)碳量子點(diǎn)的紫外光譜a及紅外光譜圖bFig.2 UV-Vis (a) and infrared spectrogram (b) of CDs

由圖1可知，可樂(lè)碳量子點(diǎn)粒度分布窄，單分散性好（平均直徑3 nm），為非結(jié)晶性物質(zhì)。從圖2a紫外吸收光譜可知，可樂(lè)碳量子點(diǎn)的吸收范圍較寬，從700 nm開始有吸收，在280 nm處有最大吸收峰。這主要是CDs sp2區(qū)域的π-π*躍遷。圖2b紅外光譜對(duì)3428.69 nm、3244.78 nm分別為游離及締合-NH2的特征吸收峰，2923.91 nm為亞甲基反對(duì)稱伸縮振動(dòng)的特征吸收峰；在1382 cm-1、1190 cm-1及1040 cm-1對(duì)應(yīng)的分別為不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)的C-O-C峰，1632.60 cm-1處為伸縮振動(dòng)。說(shuō)明表面有大量羥基及羧基的存在。因此，這些基團(tuán)對(duì)可樂(lè)碳量子點(diǎn)的改性與應(yīng)用起到重要的作用。同時(shí)，羥基以及羧基的大量存在使得碳量子點(diǎn)具有極強(qiáng)的溶解性，凍干后極易吸潮。

圖3 可樂(lè)碳量子點(diǎn)的激發(fā)/發(fā)射光譜a及其波長(zhǎng)依賴性發(fā)射bFig.3 Excitation/emission spectra of CDs (a),wavelength-dependent emission of CDs (b)

從圖3a可知，可樂(lè)碳量子點(diǎn)的最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為295 nm/390 nm，在295 nm光激發(fā)下可發(fā)射出390 nm的熒光。如圖3b所示，其發(fā)射具有明顯的波長(zhǎng)依賴性，CDs隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增大，其熒光發(fā)射峰從450 nm紅移至520 nm。與此同時(shí)，發(fā)射峰強(qiáng)度也逐漸減弱。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能有以下兩種：（1）不同尺寸的碳量子點(diǎn)納米粒子對(duì)光的選擇性存在差異；（2）由可樂(lè)碳量子點(diǎn)表面缺陷引起的，也就是表面的發(fā)射空穴不同引起的。利用這些性質(zhì)可以控制熒光發(fā)射。

2.2 不同濃度的碳量子點(diǎn)溶液對(duì)于多種常見(jiàn)菌的抑制效果

探討濃度分別為2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、500 mg/L和1000 mg/L的碳量子點(diǎn)溶液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌等5種常見(jiàn)菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)碳量子點(diǎn)對(duì)這5種菌均無(wú)抑制效果，結(jié)果見(jiàn)表1。CDs溶液濃度高達(dá)1000 mg/L時(shí)仍對(duì)這五種菌無(wú)抑制效果，從側(cè)面說(shuō)明可樂(lè)碳量子點(diǎn)并沒(méi)有細(xì)胞毒性，或者說(shuō)生物毒性較低。

在細(xì)胞水平上，碳量子點(diǎn)的毒性已經(jīng)得到多方面的研究。Liu等[20]采用甲硝唑?yàn)樵现苽涞奶剂孔狱c(diǎn)對(duì)牙齦卟啉單胞菌具有抑菌效果，推測(cè)所得的碳量子點(diǎn)是否具有抑菌效果僅與合成或者提取CDs的原料有關(guān)。另外，通過(guò)表面修飾官能化的CDs大部分仍具有較低毒性，如Ray等人發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞在接觸高達(dá)100 μg/mL碳量子點(diǎn)后，細(xì)胞活力仍保持在80%左右[21]。

如果用于碳量子點(diǎn)表面鈍化的基團(tuán)具有一定的毒性，合成后的碳量子點(diǎn)可能對(duì)細(xì)胞會(huì)帶有一定的細(xì)胞毒性。如，用PPEI-EI鈍化后的碳量子點(diǎn)具有較高的細(xì)胞毒性。

表1 不同濃度碳量子點(diǎn)溶液的抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of antibacteria test with different concentrations of CDs

2.3 不同濃度碳量子點(diǎn)溶液下供試菌的生長(zhǎng)狀況

圖4 不同濃度碳量子溶液對(duì)供試菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of CDs on the growth of bacterium

如圖4所示，發(fā)現(xiàn)五種微生物中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，在6 mm孔洞附近，隨著所加碳量子點(diǎn)溶液濃度達(dá)到100 mg/L后，孔周圍的菌落明顯密集起來(lái)。而其余三種菌并未出現(xiàn)相同情況。這是否因?yàn)榇竽c桿菌、金黃色葡萄球菌對(duì)于碳源敏感度高，所需的碳源比例較大，有待進(jìn)一步探索。

3 結(jié)論

本文采用隨處可見(jiàn)的可口可樂(lè)飲料為原料，通過(guò)簡(jiǎn)單的濃縮、透析直接獲得可樂(lè)碳量子點(diǎn)，經(jīng)電鏡、紫外分光光度計(jì)、紅外光譜及熒光分光光度計(jì)等手段表征了碳量子點(diǎn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，通過(guò)微生物抑菌實(shí)驗(yàn)，探索了該碳量子點(diǎn)材料對(duì)常見(jiàn)革蘭氏陰性、陽(yáng)性細(xì)菌以及真菌的抑制效果。結(jié)果表明，提取的碳量子點(diǎn)并無(wú)抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的功效。因此，從側(cè)面說(shuō)明可樂(lè)碳量子點(diǎn)具有較高的生物安全性。通過(guò)濃縮和透析方法獲得的碳量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率較低，會(huì)影響CDs在生物成像等方面的應(yīng)用，這是后續(xù)研究中急需改善的地方，本研究不僅拓寬了碳量子點(diǎn)的獲取手段，而且為可樂(lè)碳量子點(diǎn)后續(xù)的提取制備以及生物應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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