嗜肺軍團菌感染對巨噬細胞RAW264.7細胞因子表達的影響

于紀棉 張玉琳 曾斌 黃素文 趙秀玲 王建峰 劉玉新

嗜肺軍團菌是一種兼性細胞內(nèi)寄生的人畜共患病病原體，廣泛存在于天然淡水和人工水域等多種水體環(huán)境中。近些年我國幾大城市集中空調(diào)冷卻塔嗜肺軍團菌污染調(diào)查結(jié)果顯示嗜肺軍團菌污染嚴重：上海51.60%，江蘇鎮(zhèn)江15.00%～46.67%、深圳46.20%[1-3]。嗜肺軍團菌感染人類的主要途徑為中央空調(diào)冷卻塔工作時形成的含菌氣溶膠，被免疫力低下的人群吸入，導致患者全肺發(fā)生炎癥反應(yīng)及肺部實質(zhì)性病變，從而導致致命的急性呼吸道感染，在我國已有小規(guī)模暴發(fā)及散發(fā)病例報道。由于軍團菌性肺炎與其他肺炎不易區(qū)別，病死率可高達15%～20%[4-6]。當前城市化進程加快，大型建筑增多，城市人口居住密度增高，軍團菌病爆發(fā)和流行的可能性亦增高。嗜肺軍團菌可被巨噬細胞吞噬，但卻不能被其消滅，反而會在巨噬細胞內(nèi)復制、繁殖。嗜肺軍團菌逃逸巨噬細胞的殺傷作用也是其具有極大致病性的主要原因。本研究通過構(gòu)建嗜肺軍團菌體外感染巨噬細胞模型，檢測巨噬細胞感染后分泌細胞因子的變化，探索嗜肺軍團菌在巨噬細胞胞內(nèi)生存的分子機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所；嗜肺軍團菌ATCC33152購自上海復祥生物科技有限公司；BCYEα培養(yǎng)基購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國GE公司；胎牛血清購自德國PAN公司；RNeasy Plant Mini Kit購自德國QIAGEN公司；EasyScript Fist-Stand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物科技有限公司；Roche-LightCycler480Ⅱ熒光PCR儀購自美國羅氏公司；DMi8倒置顯微鏡購自德國萊卡公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)巨噬細胞RAW264.7 采用10%FBS的DMEM高糖細胞培養(yǎng)液，置于含5%CO2的37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d傳代1次。使用時采用0.1%的胰酶消化使其懸浮，計數(shù)并調(diào)整其濃度為1×106個/ml，鋪于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 嗜肺軍團菌培養(yǎng)及菌懸液制備 嗜肺軍團菌接種BCYEα培養(yǎng)基，培養(yǎng)5d，分別挑取生長狀況良好的菌落，于BCYEα液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min培養(yǎng)過夜后取等量菌體轉(zhuǎn)接至250 ml BCYEα液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)。對數(shù)生長期測定菌體的密度，用DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS）稀釋成菌懸液，調(diào)整細菌濃度。

1.2.3 嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7 嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7參照熊麗娜等[7]方法，巨噬細胞RAW264.7以1×106/孔，鋪6孔板，根據(jù) OD600值調(diào)節(jié)細菌濃度，按感染復數(shù)（MOI）為10感染巨噬細胞RAW264.7。培養(yǎng)體系為室溫800g離心10 min，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)1h，移除含菌液的培養(yǎng)基，加入含硫酸慶大霉素200 mg/L的新鮮DMEM培養(yǎng)基，相同條件下，處理1h以殺死細胞外的軍團菌。移除培養(yǎng)基，PBS輕輕吹洗5次，加入含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基。分別于感染前、感染后6、12、24h用鑷子取片，PBS沖洗5次，倒扣于潔凈的載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察嗜肺軍團菌在細胞內(nèi)的生長和增殖情況。

1.2.4 熒光定量PCR檢測 分別在感染前、感染后6、12、24、36h取材，用于細胞因子的檢測。按照RNeasy Plant Mini Kit試劑盒說明書提取細胞總RNA，將細胞總RNA按照EasyScript Fist-Stand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，然后進行PCR。PCR反應(yīng)條件：95℃，5min；40 個循環(huán)：95℃，15s；58℃，30s（收集熒光）；熔點曲線分析55～95℃。PCR反應(yīng)體系為：TransStart Green qPCR SuperMix 10μl，上游和下游引物各0.5μl（表1），cDNA模板2μl，雙蒸水補至20μl。測定IL-6、TNF-α、Caspase-1和 Bcl-2 4個基因，均由深圳華大基因公司合成，試驗所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt進行相對定量結(jié)果分析。

表1 各目的基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，不同時間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 嗜肺軍團菌在巨噬細胞RAW264.7內(nèi)的增殖情況 見圖1。

圖1 嗜肺軍團菌在巨噬細胞RAW264.7內(nèi)的增殖情況（a：0h；b：6h；c：12h；d：24h）

由圖1可見，顯微鏡下，正常貼壁的巨噬細胞RAW264.7呈圓形，形態(tài)完整。嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7后，其感染周期可大致分為3個階段，感染早期（0～12h）：嗜肺軍團菌被巨噬細胞RAW264.7吞噬后，會形成一個吞噬泡（圖1b箭頭所示），細菌形成明顯的復制囊泡并在其中生長繁殖?？焖僭鲋称冢?2～24h）：細菌形成明顯的復制囊泡并在其中生長繁殖，并與周圍囊泡逐漸融合形成一個或少數(shù)幾個大囊泡（圖1c箭頭所示）。傳播期（24h后）：巨噬細胞RAW264.7膜出現(xiàn)崩解（圖1d箭頭所示），有規(guī)則外形的菌團也隨之破裂，釋放出細菌，細菌緩慢地運動，逐漸擴散開去，至此嗜肺軍團菌完成了一個感染周期。

2.2 嗜肺軍團菌對巨噬細胞RAW264.7的細胞因子的影響 見圖2。

圖2 嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7后IL-6、TNF-α、Caspase-1、Bcl-2 mRNA相對表達量（與感染前比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖2可見，嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7后，IL-6 mRNA的表達量變化非常顯著，感染6h后IL-6 mRNA的表達量（14.95）顯著上升，與感染前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.14，P＜0.01），之后 IL-6 mRNA 逐漸下降，但仍高于感染前，與感染前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.9、8.6、7.5，均P＜0.05）。TNF-α mRNA 表達量在感染 6、12、24 和 36h 后分別為 4.78、3.15、3.98、2.44，雖然其變化趨勢有所波動，但與感染前比較仍顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.8、3.9、4.2、5.8，均P＜0.05）。Caspase-1 mRNA表達量在感染6h和12h時分別為2.13、2.04，與感染前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.3、9.5，均P＜0.05），感染 24h 和 36h 與感染前比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Bcl-2 mRNA表達量在感染6、12和24h分別為4.10、3.99、2.48，與感染前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.3、6.6、4.3，均P＜0.05），感染36h后與感染前比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

嗜肺軍團菌是一種細胞內(nèi)寄生菌，能感染并在人單核細胞、肺泡巨噬細胞、表皮細胞和巨噬細胞樣細胞系中復制存活[8]。本研究是以巨噬細胞RAW264.7為宿主細胞模型，研究感染嗜肺軍團菌后細胞因子的變化。

IL-6和TNF-α是導致機體炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵的細胞因子，能夠誘導細菌感染后的保護性免疫反應(yīng)，因此在宿主免疫中起到很重要的作用。TNF-α一般認為可由巨噬細胞內(nèi)源性分泌，參與細胞的增殖和分化、腫瘤的形成、細胞的凋亡、壞死等[9]。本試驗結(jié)果顯示，巨噬細胞RAW264.7感染嗜肺軍團菌6h后，IL-6和TNF-α表達量顯著上升，之后隨著感染時間的延長雖有所下降，但其表達量仍高于正常。佳莉娟等[10]在研究重組嗜肺軍團菌鞭毛蛋白A（rflaA）感染小鼠巨噬細胞RAW264.7時也發(fā)現(xiàn)IL-6的表達水平顯著升高，與本試驗結(jié)果相符。在新近的報道中證明IL-6可以抑制由結(jié)核分枝桿菌感染引起的巨噬細胞自噬，IL-6的分泌量增加有利于結(jié)核分枝桿菌抑制機體先天性免疫應(yīng)答[11]。因此嗜肺軍團菌能夠刺激巨噬細胞發(fā)生強烈免疫反應(yīng)，大量分泌IL-6和TNF-α。IL-6幫助巨噬細胞降低自噬，激活信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子的磷酸化，從而誘導抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-XL的表達[12-13]，有利于嗜肺軍團菌長期存活。

Bcl-2是一種重要的凋亡抑制蛋白，具有保護細胞的功能作用。Ge等[14]研究也表明嗜肺軍團菌的效應(yīng)蛋白LegK1可以激活宿主的NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路，上調(diào)Bcl-2，使宿主細胞在感染后不會立刻啟動具有保護作用的凋亡程序，利于嗜肺軍團菌在宿主細胞內(nèi)的生存；另外，效應(yīng)蛋白SidF可直接與Bcl-2蛋白家族的成員相互作用，在感染過程中阻止宿主細胞凋亡。本試驗結(jié)果顯示，感染6h后Bcl-2表達量顯著上升，其后表達量逐漸降低，但仍高于對照組，說明嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7 6h后，可能是通過抑制巨噬細胞RAW264.7的凋亡來完成自己在胞內(nèi)的增殖，本試驗形態(tài)學觀察結(jié)果也顯示嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7 6h后出現(xiàn)吞噬泡，細菌形成明顯的復制囊泡并在巨噬細胞RAW264.7中生長繁殖，當細菌感染巨噬細胞RAW264.7 24h后，巨噬細胞RAW264.7胞膜出現(xiàn)崩解，有規(guī)則外形的菌團也隨之破裂，并釋放出細菌，因而致使了Bcl-2在感染后期出現(xiàn)下降趨勢。

有研究表明Caspase-1激活的程序性細胞死亡是細胞限制胞內(nèi)細菌感染的重要手段，嗜肺軍團菌感染巨噬細胞后，可激活Caspase-11，隨后通過NLRP3炎性小體和凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）激活細胞內(nèi)的Caspase-1[15]。本試驗結(jié)果顯示巨噬細胞RAW264.7感染嗜肺軍團菌初期，Caspase-1表達量顯著升高，后期表達量降低，由此可見嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7初期，細胞可以通過增加Caspase-1的表達從而激活細胞焦亡來限制嗜肺軍團菌在其體內(nèi)的增殖。

綜上所述，嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7后，細胞焦亡和抗凋亡兩種機制同時存在，從本試驗結(jié)果來看，細菌感染初期，炎癥反應(yīng)比較激烈大量炎癥因子分泌，激活了細胞焦亡，但是從整個嗜肺軍團菌感染過程來看，細菌可以在巨噬細胞RAW264.7中增殖，說明焦亡只是感染初期的一個反應(yīng)，整個感染過程還是以抗凋亡為主，嗜肺軍團菌感染巨噬細胞RAW264.7后發(fā)生炎癥反應(yīng)的確切機制仍需下一步的研究。