電針抗腦缺血再灌注損傷的機制研究進展

彭擁軍 徐疏影 李忠仁 傅淑平 儲繼紅 姜鵬君 朱冰梅

[摘要] 腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)常見病及多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類的健康。針灸治療腦卒中已獲得廣泛認(rèn)可，針灸可有效抑制腦缺血發(fā)生后產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)及神經(jīng)元損傷。本文探討電針干預(yù)腦缺血再灌注損傷的機制，為電針在臨床上治療該疾病提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血再灌注;電針;血腦屏障;細(xì)胞自噬;機制研究

[中圖分類號] R245? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（a）-0051-04

Advances in mechanism research on electroacupuncture in treatment of cerebral ischemia reperfusion injury

PENG Yongjun1? ?XU Shuying2? ?LI Zhongren2? ?FU Shuping2? ?CHU Jihong1? ?JIANG Pengjun1? ?ZHU Bingmei3

1.The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing? ?210029， China; 2.Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing? ?210029， China; 3.West China Hospital， Sichuan University， Sichuan Province， Chengdu? ?610041， China

[Abstract] Stroke is a common and frequently-occurring disease of the nervous system， which is a serious threat to human health. Acupuncture treatment of stroke has been widely recognized， acupuncture can effectively inhibit the cascade reaction and neuronal damage after cerebral ischemia. This article discusses the mechanism of electroacupuncture intervention for cerebral ischemia-reperfusion injury， and provides a theoretical basis for the treatment of this disease by electroacupuncture.

[Key words] Cerebral ischemia-reperfusion; Electmacupuncture; Blood brain barrier; Autophagy; Mechanism research

腦卒中發(fā)病率逐年上升，其因較高的致殘率、致死率及復(fù)發(fā)率，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。2012年WHO報道[1]表明，腦卒中是全球范圍內(nèi)繼冠心病與癌癥排名第三的致死病因，其每年首次發(fā)病人數(shù)高達(dá)1030萬，且有11 300萬傷殘調(diào)整壽命年（DALY）。而在我國，腦卒中是致殘率第一、致死率第二的高發(fā)疾病[2]，其中約70%為缺血性腦卒中。腦梗死后50%以上的梗死血管可自發(fā)再通，然而在缺血腦組織恢復(fù)血供、挽救瀕死腦細(xì)胞的同時，神經(jīng)細(xì)胞加速級聯(lián)反應(yīng)損傷，使腦缺血組織損害加重，最終誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死，致使神經(jīng)功能破壞與梗死灶形成，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）。針刺作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)療法被廣泛運用于腦卒中患者的防治，近年來，國內(nèi)大量數(shù)據(jù)為電針治療腦缺血再灌注損傷提供科學(xué)依據(jù)，本文就此討論電針干預(yù)CIRI的作用機制。

1 改善能量代謝

腦細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙與CIRI的發(fā)生密切相關(guān)。雖然引起CIRI的原因復(fù)雜多樣，但目前認(rèn)為生物能量學(xué)的改變是造成CIRI的決定性因素。能量代謝障礙直接或間接地影響腦細(xì)胞構(gòu)成及生理學(xué)進程[3]，其被認(rèn)為是缺血性腦損傷的初始環(huán)節(jié)，是最早期、最迅速、最直接發(fā)生的病理損傷[4]。Rutkai等[5]通過電鏡、蛋白質(zhì)印跡，計算線粒體氧消耗率（OCR）后發(fā)現(xiàn)，CIRI后大腦中動脈的線粒體結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，其不僅影響OCR，也影響Ca2+活性。而針刺被證明可有效緩解能量代謝障礙。陳斌[6]選取原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞進行ATP耗竭處理，采用特異性的內(nèi)源性Cofilin和神經(jīng)元Marker免疫熒光染色和Tunel染色，結(jié)果顯示ATP耗竭可誘導(dǎo)Cofilin rod異常結(jié)構(gòu)的形成，從而阻礙樹突和軸突的胞漿運輸，抑制線粒體和早期內(nèi)涵體的移動，進一步導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡;而急性期電針針刺百會、神庭穴可減少Cofilin rod形成和MAP2降解，調(diào)節(jié)Cofilin的線粒體轉(zhuǎn)位，減輕缺血性卒中的腦損傷。

2 抑制興奮性氨基酸分泌

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，氨基酸是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，而腦缺血后興奮性氨基酸（EAA）含量過多可進一步加快神經(jīng)細(xì)胞死亡。EAA中最主要的為谷氨酸（Glu），其不僅是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，也是影響細(xì)胞通訊及神經(jīng)元重塑、再生、分化的重要神經(jīng)調(diào)質(zhì)。腦缺血破壞了Glu的攝取機制，使細(xì)胞外Glu濃度上調(diào)，過度激活谷氨酸受體，產(chǎn)生興奮毒性。而大量實驗數(shù)據(jù)已證明電針可抑制其毒副作用，減輕對神經(jīng)細(xì)胞造成的傷害，如楊忠華等[7]采用免疫熒光法觀察電針對MACO模型大鼠CA3及NR1的表達(dá)影響，結(jié)果顯示電針組IOD值較模型組降低，提示電針可降低NR1，干預(yù)腦缺血早期Glu對神經(jīng)元可能產(chǎn)生的毒性作用。劉曌宇[8]對C57BL/6小鼠短暫全腦缺血模型進行電針預(yù)處理，最終發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可通過激活CB1R調(diào)控海馬神經(jīng)元上GluR2蛋白的表達(dá)水平來誘導(dǎo)快速相神經(jīng)保護作用。

3 降低Ca2+超載損傷

CIRI發(fā)生的機制與Ca2+超載密切相關(guān)。其可觸發(fā)一系列下游反應(yīng)，其中包括胱天蛋白酶激活、ATP合成抑制、鈣依賴性蛋白酶與核酸酸內(nèi)切酶的激活等，最終導(dǎo)致CIRI后神經(jīng)元的損傷與死亡。近年來，相關(guān)基礎(chǔ)實驗證實針刺可調(diào)控CIRI后Ca2+通道，減少Ca2+內(nèi)流，以保護腦組織，如墻建軍等[9]對小鼠取百會和大椎穴進行電針預(yù)處理，造模后使用蛋白免疫印跡檢測神經(jīng)元TRPC6和Caspase-3蛋白表達(dá)，鈣影像檢測細(xì)胞內(nèi)相對Ca2+濃度，發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可明顯抑制大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞TRPC6與Caspase-3蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

柳四新等[10]通過對大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型實驗發(fā)現(xiàn)，Glu明顯增加腦水腫程度，而在體外神經(jīng)元培養(yǎng)中，Glu顯著增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，提示Glu在腦缺血再灌注中通過L-型鈣通道鈣內(nèi)流后激活鈣庫釋放，致Ca2+超載，最終導(dǎo)致腦水腫。沈攀攀[11]以太沖為主穴，觀察針刺對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）延髓頭端腹外側(cè)區(qū)Glu的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組Glu含量均高于正常對照組，針刺組Glu含量明顯低于模型組，提示針刺可明顯降低Glu含量。綜上可知，針刺可下調(diào)Glu含量，降低腦缺血再灌注損傷后Ca2+超載現(xiàn)象，保護腦組織。

4 調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激反應(yīng)是機體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，氧化程度超出氧化物的清除速度，高活性分子引起炎癥細(xì)胞侵入，而造成細(xì)胞損傷。而在腦缺血發(fā)生后自由基超氧物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）可損害神經(jīng)元富含脂質(zhì)的腦細(xì)胞，使多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而引起生物膜裂解，蛋白質(zhì)變性，神經(jīng)元凋亡[12]。因此，探究抗氧化損傷對防治CIRI有重要意義。林浴坤等[13]通過對MACO大鼠電針神庭、百會穴干預(yù)7 d后，用化學(xué)比色法檢測SOD、MDA和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），發(fā)現(xiàn)電針神底、百會穴可明顯改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀并增強SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量，表明電針通過抑制氧化應(yīng)激、控制神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡。侯志濤等[14]通過電針“智三針”（神庭穴和雙側(cè)本神穴）干預(yù)14 d后發(fā)現(xiàn)，較模型組而言，電針組SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯降低;且電針組血清中3項指標(biāo)及海馬GSH-Px活性的改善程度較藥物組明顯，提示電針“智三針”可在CIRI后降低海馬內(nèi)氧自由基含量，從而抑制細(xì)胞凋亡，并提高學(xué)習(xí)記憶能力。綜上可知，電針可通過增強SOD及GSH-Px活性，降低MDA含量，從抗氧化損傷角度防治CIRI。

5 緩解炎性反應(yīng)

腦卒中后內(nèi)環(huán)境發(fā)生系列復(fù)雜變化，其誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子及黏附分子等，導(dǎo)致神經(jīng)組織的二次損傷[15]。當(dāng)血管再通時，炎性因子進入血腦屏障，加重腦組織損傷。電針可抑制炎性反應(yīng)，調(diào)控促炎因子與抗炎因子的動態(tài)平衡，縮小梗死體積，保護神經(jīng)組織。

抗炎與致炎因子在炎性反應(yīng)中十分重要。方晨晨等[16]通過針刺大鼠的百會和大椎穴，將其與假實驗組與模型組比較，電針組大鼠白細(xì)胞介素-4（IL-4）蛋白及mRNA的表達(dá)顯著升高，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）蛋白及mRNA的表達(dá)顯著減少，且IL-4與TNF-α的蛋白含量比值和mRNA含量比值亦顯著提高，提示電針可以通過增加IL-4表達(dá)量，降低TNF-α表達(dá)量，以提升IL-4與TNF-α的比值而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，從而抑制缺血再灌注區(qū)的炎性反應(yīng)，減小梗死體積。葉濤等[17]對大鼠進行2周針灸預(yù)處理，通過ELISA法檢測血清TNF-α、IL-10含量，發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可調(diào)節(jié)腦缺血再灌注急性期外周循環(huán)血中促炎因子TNF-α與抗炎因子IL-10動態(tài)平衡，減小CIRI后神經(jīng)功能受損。

6 調(diào)控血腦屏障及腦水腫

血腦屏障作為彌散屏障，位于血液及腦、脊髓之間，保障大部分化合物不可進入腦組織，以維持中樞系統(tǒng)功能正常的中心環(huán)節(jié)。在CIRI時，血腦屏障超微結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，通透性增加，導(dǎo)致腦水腫。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)增加與血腦屏障的破環(huán)密切相關(guān)，其中MMP-9和MMP-2被認(rèn)為是血腦屏障損傷的標(biāo)志物之一[18]。電針可下調(diào)MMP-9與MMP-2表達(dá)，抑制腦水腫。邢東[19]于再灌注48 h后處死MACO模型，取梗死側(cè)及對側(cè)腦組織，使用免疫組織化學(xué)、免疫蛋白印記及明膠酶譜技術(shù)檢測各組大鼠腦組織內(nèi)MMP-9的活性及表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針組半暗帶的皮層與紋狀體區(qū)域內(nèi)MMP-9的表達(dá)明顯減少，活性明顯降低，可推測電針預(yù)處理可以通過降低腦缺血后MMP-9的水平與活性來減輕對血腦屏障通透性的影響，改善腦水腫，發(fā)揮腦保護作用。李一陽[20]通過觀察針刺對各組大鼠海馬組織中MMP-2酶活性的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，缺血模型組大鼠海馬組織中MMP-2酶活性明顯上調(diào)，與溶栓組比較，針刺組能夠下調(diào)大鼠缺血區(qū)組織中MMP-2酶的活性，尤其以針刺干預(yù)6 h亞組改善最顯著，提示針刺可抑制MMP-2酶的過度生成，實現(xiàn)對血腦屏障結(jié)構(gòu)功能的保護，從而降低腦組織損傷。

7 調(diào)控細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核生物中的程序性降解機制，在生理病理中起重要作用，其被認(rèn)為腦缺血后半暗帶內(nèi)的細(xì)胞自噬作為細(xì)胞第三種死亡方式先于凋亡發(fā)生。針刺作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在防治CIRI中效果顯著，研究者通過復(fù)制大鼠腦缺血再灌注模型，以證實細(xì)胞自噬在針刺減輕大鼠CIRI中的機制。馮曉東等[21]將大鼠MACO造模成功后2 h后取神庭、百會穴進行電針干預(yù)，檢測大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ的含量及腦組織中細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ/Ⅱ比值，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，電針組大鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)均明顯升高，腦梗死體積明顯縮小。由此可知，電針神庭、百會穴可上調(diào)MACO大鼠的自噬相關(guān)蛋白LC3的水平，從而提高神經(jīng)功能。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（UPR）是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的重要信號通路。

8 結(jié)語

針灸治療腦卒中臨床效果已獲得廣泛認(rèn)可，針灸可有效抑制腦缺血發(fā)生后產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)及神經(jīng)元損傷。電針抗CIRI的機制比較復(fù)雜，各機制間為多因素協(xié)同、多途徑介導(dǎo)，而又相互影響的復(fù)雜過程。應(yīng)利用現(xiàn)代科技手段進一步深入探討針灸干預(yù)CIRI的機制，為臨床提供嶄新的思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Feigin VL，Krishnamurthi RV，Parmar P，et al. Update on the global burden of ischemic and haemorrhagic stroke in 1990-2013：the GBD 2013 study [J]. Neuroepidemiology，2015，45（3）：161-176.

[2]? 秦莉花，黃娟，李晟，等.腦卒中流行病學(xué)及與性激素的相關(guān)性[J].中國老年雜志學(xué)，2018，38（20）：5099-5103.

[3]? Chomova M. Look into brain energy crisis and membrane pathophysiology in ischemia and reperfusion [J]. Stress，2016，19（4）：341-348.

[4]? 朱慧淵，王江，苗琦.基于“脾主運化”理論仙鶴草調(diào)控線粒體能量代謝抗腦缺血損傷的探討[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（12）：2929-2931.

[5]? Rutkai I，Merdzo I，Wunnava SV，et al. Cerebrovascular function and mitochondrial bioenergetics after ischemia-reperfusion in male rats [J]. J Cereb Blood Flow Metab，2017，39（6）：0271678X1774502. doi：10.1177/0271678X 17745028.

[6]? 陳斌.基于Cofilin介導(dǎo)細(xì)胞凋亡探討電針促進腦缺血大鼠認(rèn)知功能恢復(fù)的作用機制[D].福州：福建中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[7]? 楊忠華，許能貴，易瑋，等.NMDAR1在腦缺血模型大鼠不同時段的表達(dá)及針刺干預(yù)作用的研究[J].新中醫(yī)，2017， 42（3）：77-79.

[8]? 劉曌宇.電針預(yù)處理通過CB1R調(diào)控神經(jīng)元GluR2誘導(dǎo)腦缺血耐受作用的研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2014.

[9]? 墻建軍，王林華.電針預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元TRPC6表達(dá)的影響[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017， 19（2）：8-12.

[10]? 柳四新，何丹，余孝君，等.谷氨酸致腦缺血再灌注損傷中鈣超載的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（7）：20-23.

[11]? 沈攀攀.針刺對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓效應(yīng)及其中樞Asp、Glu調(diào)節(jié)機制[D].杭州：浙江中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[12]? 趙安東，李玉亮，辛益妹，等.銀杏葉提取物對大鼠腦缺血再灌注氧化損傷的保護作用[J].空軍醫(yī)學(xué)雜志，2013， 29（2）：93-95.

[13]? 林浴坤，林如輝，陳斌，等.電針對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠學(xué)習(xí)記憶作用的氧化應(yīng)激機制[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（8）：755-760.

[14]? 侯志濤，孫忠人，劉松濤，等.電針對缺血性學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠氧自由基及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].針刺研究，2015，40（6）：431-433.

[15]? 徐文韜，李一陽，倪光夏腦缺血再灌注后血腦屏障損傷及針灸干預(yù)機制研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，19（8）：58.

[16]? 方晨晨，范茜茜，金曉露，等.電針對腦缺血再灌注損傷大鼠IL-4、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2018，29（7）：1767-1770.

[17]? 葉濤，朱路文，唐強，等.電針預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積及血清TNF-α、IL-10含量的影響[J].中國針灸，2017，37（10）：1093-1097.

[18]? Zhang S，An Q，Wang T，et al. Autophagy- and MMP2/9-mediated reduction and redistribution of ZO-1 contribute to hyperglycemia-increased blood-brain barrier permeability during early reperfusion in stroke [J]. Neuroscience，2018，377：126-137.doi：10.1016/j.neuroscience.2018.02.035.

[19]? 邢東.電針預(yù)處理通過MMP9調(diào)節(jié)TJP誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受的研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2015：43-53.

[20]? 李一陽.針刺抑制基質(zhì)金屬蛋白酶可延長腦梗死溶栓時間窗的實驗研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2017：29-54.

[21]? 馮曉東，黃金，李瑞青，等.電針神庭、百會穴對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 及大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)LC3蛋白表達(dá)的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2018，29（8）：2020-2024.