黃藤素對急性肺損傷小鼠肺組織NF-KB蛋白表達和激活的影響

李莉 王應(yīng)霞 楊桂梅 尹健彬 張旋

[摘要] 目的 研究黃藤素對急性肺損傷（ALI）小鼠肺組織核因子-κB（NF-κB）表達和激活的影響。 方法 雄性SPF昆明小鼠60只按照抽簽法隨機分為6組（每組10只）：ALI組[氣管滴入5 mg/kg脂多糖（LPS）]，正常對照組（假手術(shù)處理），陽性對照組（3.3 mg/kg氫化可的松注射液+ LPS），黃藤素低、中、高劑量組（2、10 mg/kg和50 mg/kg黃藤素注射液+LPS）。陽性藥物和黃藤素均在模型建立前腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d。采用免疫組織化學(xué)法檢測NF-κB p65蛋白在肺組織中的表達與定位。采用Western blot法檢測磷酸化NF-κB p65蛋白的表達情況。 結(jié)果 與ALI組比較，黃藤素中、高劑量組小鼠肺組織中NF-κB p65蛋白進入細(xì)胞核的陽性細(xì)胞百分率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與ALI組比較，黃藤素低、中、高劑量組小鼠肺組織磷酸化NF-κB p65蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 黃藤素對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有防治作用，該作用與抑制NF-κB蛋白表達和激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 黃藤素;急性肺損傷;脂多糖;核因子-κB;蛋白表達

[中圖分類號] R563.1? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（a）-0007-04

Effect of Fibrauretin on the protein expression and activation of NF-κB in lung tissues of mice with acute lung injury

LI Li1? ?WANG Yingxia2? ?YANG Guimei3? ?YIN Jianbin3? ?ZHANG Xuan3

1.Biotherapy Center， the 3rd Affiliated Hospital of Kunming Medical University Tumor Hospital of Yunnan Province， Yunnan Province， Kunming? ?650106， China; 2.Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming? ?650032， China; 3.School of Pharmaceutical Sciences & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products， Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming? ?650500， China

[Abstract] Objective To study the effect of Fibrauretin on the protein expression and activation of nuclear factor kappa B （NF-κB） in lung tissues of mice with acute lung injury （ALI）. Methods Sixty male SPF Kunming mice were randomly divided into 6 groups by drawing lots （10 mice in each group）： ALI group [（intratracheal instillation of 5 mg/kg lipopolysaccharide （LPS）]， normal control group （sham operation）， positive control group （3.3 mg/kg Hydrocortisone Injection + LPS）， low， medium and high doses of Fibrauretin groups （2， 10 mg/kg and 50 mg/kg Fibrauretin Injection + LPS）. The positive drug and Fibrauretin were given by intraperitoneal injection once a day for 3 consecutive days before establishment of ALI model. Immunohistochemistry was used to detect the expression and localization of NF-κB p65 protein in lung tissues. Western blot was used to detect the expression of phosphorylated NF-κB p65 protein in lung tissues. Results Compared with ALI group， the percentage of positive cells with the entry of NF-κB p65 protein into the nucleus in lung tissues of mice in medium and high doses of Fibrauretin groups was decreased significantly， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with ALI group， the protein expression of phosphorylated NF-κB p65 in lung tissues of mice in low， medium and high doses of Fibrauretin group was down-regulated significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Fibrauretin has preventive effect on LPS-induced acute lung injury in mice， and the effect is related to the inhibition of the protein expression and activation of NF-κB.

[Key words] Fibrauretin; Acute lung injury; Lipopolysaccharide; NF-κB; Protein expression

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種臨床常見危重病癥，發(fā)展至嚴(yán)重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ALI可由多種原因引起，如細(xì)菌感染、創(chuàng)傷、毒氣吸入、機械通氣等，其中細(xì)菌感染最多見[1-2]。ALI起病急、進展快，嚴(yán)重危及患者生命[3]。故ALI往往需要迅速及時治療。然而，目前臨床治療措施和藥物治療效果并不理想，因此研發(fā)新型高效低毒的ALI防治藥物非常必要。

黃藤素是我國研制的純天然植物藥，成分為鹽酸巴馬汀，具有抗菌、消炎、清熱解毒等多種功效，因此被稱為“植物抗生素”[4-6]。黃藤素臨床主要用于各種炎癥和感染性疾病，如婦科炎癥、菌痢、腸炎、呼吸道及泌尿道感染等。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素能夠明顯減輕脂多糖致ALI小鼠肺組織炎性反應(yīng)[7]。然而，黃藤素抗ALI的作用機制尚不清楚。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、組織損傷、腫瘤生長等多種過程[8-9]。NF-κB信號通路是重要的炎癥信號通路，而ALI的本質(zhì)是肺內(nèi)失控性炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路激活在ALI發(fā)病機制中起著重要作用[10-11]。因此，本研究旨在探討黃藤素對ALI時肺組織NF-κB表達和激活的影響，初步闡明黃藤素抗ALI的機制。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑

黃藤素注射液購自昆藥集團股份有限公司，氫化可的松注射液購自百正藥業(yè)股份有限公司;戊巴比妥鈉購自Merk公司;脂多糖（O111：B4）購自Sigma公司;NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65多克隆抗體、GAPDH抗體購自Elabscience公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自TIANGEN公司;RIPA高效蛋白裂解液購自Solarbio公司;蛋白Marker購自Thermo公司。免疫組化試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物分組與處理

健康雄性SPF級昆明小鼠60只，體重18～22 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部。在恒溫、恒濕環(huán)境、明暗各12 h周期的飼養(yǎng)室常規(guī)喂養(yǎng)，實驗前禁食12 h。按抽簽法隨機分為6組：ALI組（手術(shù)暴露氣管，用微量注射器經(jīng)氣管滴入5 mg/kg脂多糖，隨后將小鼠直立旋轉(zhuǎn)2周），正常對照組（假手術(shù)處理），陽性對照組（3.3 mg/kg氫化可的松注射液+脂多糖），黃藤素低、中、高劑量組（2、10 mg/kg和50 mg/kg黃藤素注射液+脂多糖），每組10只。陽性藥物和黃藤素均在模型建立前腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d。在氣管滴入脂多糖后24 h處死小鼠，取出肺組織檢測各項指標(biāo)。ALI模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)：組織結(jié)構(gòu)上觀察到肺泡腔明顯縮小、部分肺泡塌陷，肺泡間隔增厚、炎癥細(xì)胞浸潤，NF-κB免疫組化染色細(xì)胞核染為棕色，表明炎癥信號激活，發(fā)生急性肺部炎癥。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測NF-κB表達和定位

常規(guī)制作病理切片;常規(guī)脫蠟、脫水;阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶;微波抗原修復(fù);血清工作液封閉，37℃ 10 min;滴加NF-κB p65一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗3×5 min;滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min;滴加HRP標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min;DAB染色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察。陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核深染為棕褐色為陽性細(xì)胞，表明NF-κB激活進入細(xì)胞核。

1.4 Western blot法檢測磷酸化NF-κB蛋白表達

常規(guī)提取蛋白;行SDS-PAGE電泳;常規(guī)轉(zhuǎn)膜;進行免疫反應(yīng)：用0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入包被液，室溫2 h;棄包被液，0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入p-NF-κBp65一抗（4℃ 12 h）。棄一抗和1% mol/L BSA，0.01 mol/L PBS分別洗膜，5 min×3次;加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗，平穩(wěn)搖動，室溫2 h;棄二抗，0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入顯色液;凝膠成像儀檢測，使用Quantity One軟件進行灰度測定，以GADPH為內(nèi)參計算p-NF-κBp65蛋白相對表達量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用q檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃藤素對ALI小鼠肺組織NF-κB表達和定位的作用

與正常對照組比較，ALI組小鼠肺組織肺泡腔明顯縮小、部分肺泡塌陷，肺泡間隔增厚，免疫組化染色顯示肺組織細(xì)胞核被深染為棕色，表明NF-κB p65進入細(xì)胞核，NF-κB激活，肺內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng)。正常對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，棕色著色淺，且主要分布于細(xì)胞漿，細(xì)胞核為藍(lán)色，表明NF-κB未激活;與ALI組比較，陽性對照組、黃藤素中劑量和黃藤素高劑量組小鼠肺組織棕色著色較淺，細(xì)胞核棕染的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。陽性細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，各組陽性細(xì)胞百分率均較正常對照組明顯降低（P < 0.01）;陽性對照組、黃藤素中劑量組陽性細(xì)胞百分率低于ALI組（P < 0.05）;黃藤素中劑量和高劑量能夠明顯減少陽性細(xì)胞百分率，與ALI組和黃藤素低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;黃藤素高劑量組陽性細(xì)胞百分率也明顯低于正常對照組及陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1～2。

A：ALI組;B：正常對照組;C：陽性對照組;D：黃藤素低劑量組;E：黃藤素中劑量組;F：黃藤素高劑量組。ALI：急性肺損傷;NF-κB：核因子-κB和核定位（免疫組化，100×）? ?與正常對照組比較，**P < 0.01;與ALI組比較，#P < 0.05;與陽性對照組比較，$P < 0.05;與低劑量組（黃藤素低劑量組）比較，&P < 0.05。ALI：急性肺損傷;NF-κB：核因子-κB

2.2 黃藤素抑制ALI小鼠肺組織磷酸化NF-κBp65蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示，ALI組、陽性對照組及黃藤素低、中高劑量組小鼠肺組織磷酸化NF-κB p65蛋白表達明顯均上調(diào)，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;與ALI組比較，黃藤素低、中、高劑量組小鼠肺組織磷酸化NF-κBp65蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;與陽性對照組比較，黃藤素低、高劑量組小鼠肺組織磷酸化NF-κBp65蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），但黃藤素的劑量依賴關(guān)系不明顯。見圖3～4。

3 討論

目前臨床上ALI的主要治療措施為保護性肺通氣和應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，然而療效并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，一些天然產(chǎn)物可以通過抑制炎癥信號通路發(fā)揮抗ALI的作用，如姜黃素、人參皂苷Rg5、迷迭香酸、異佛司可林等[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素能夠明顯抑制ALI小鼠肺內(nèi)炎性反應(yīng)，減輕肺損傷程度，但其抗急性肺損傷的機制尚不清楚[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路過度激活在ALI時炎癥細(xì)胞因子過度釋放中發(fā)揮重要作用[10-11]。各種引起ALI的因素均可激活NF-κB，啟動下游多種炎癥因子過度表達，導(dǎo)致ALI[13-14]。因此，NF-κB過度激活是ALI發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制NF-κB激活能夠減輕ALI。黃藤素能否通過抑制NF-κB激活而減輕ALI呢？研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素可通過抑制TRIF依賴的NF-κB信號通路而抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)[15]。據(jù)此推測，黃藤素可能通過抑制NF-κB的激活從而發(fā)揮抗ALI作用。

NF-κB一般以二聚體（主要為p50/p65）形式存在于細(xì)胞漿中，未激活時與NF-κB抑制蛋白（IκB）結(jié)合，形成無活性復(fù)合體[16-18]。IκB有多種亞型，其中IκBα最重要，抑制NF-κB作用最強[19]。細(xì)胞外刺激信號可通過細(xì)胞膜受體傳遞到細(xì)胞內(nèi)，IκB即被磷酸華，繼而被泛素化，失去活性，釋放出游離的NF-κB，NF-κB即被磷酸化激活，隨后進入細(xì)胞核，啟動靶基因表達[20-22]。因此，NF-κB進入細(xì)胞核是NF-κB激活的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，與ALI組比較，黃藤素中劑量和高劑量組小鼠肺組織NF-κB p65蛋白進入細(xì)胞核的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明黃藤素能夠明顯抑制NF-κB激活，有一定劑量依賴關(guān)系。

NF-κB磷酸化水平也可反映其激活情況，因此，本研究采用Western blot法檢測了磷酸化NF-κB p65蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)ALI時肺組織磷酸化NF-κB p65蛋白表達明顯上調(diào)，提示NF-κB被激活，而低、中、高劑量黃藤素均能下調(diào)肺組織磷酸化NF-κB p65蛋白表達，表明黃藤素能夠抑制NF-κB信號通路激活，發(fā)揮抗ALI作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃藤素抑制ALI小鼠肺炎性反應(yīng)有一定劑量依賴關(guān)系[7]。但本研究中黃藤素下調(diào)磷酸化NF-κB p65蛋白表達的劑量依賴關(guān)系不明顯，其原因可能是Western blot法檢測樣本只是整個肺組織的一部分，氣管滴入脂多糖在肺局部分布不均造成的。

綜上所述，黃藤素能夠明顯下調(diào)ALI小鼠肺組織NF-κB表達，并抑制NF-κB磷酸化水平，從而抑制NF-κB信號通路激活，發(fā)揮抗ALI的作用。本研究初步發(fā)現(xiàn)了黃藤素抗ALI作用機制之一是抑制了肺內(nèi)炎癥相關(guān)NF-κB信號通路。

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