柚皮素通過自噬抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

葉志東 黃子圣 甘 玲 李佩霖 胡惠瓊 胡亞楠 徐 蓮，4 吳品信 趙 俐古維立

1 廣州市第一人民醫(yī)院普通外科（廣東廣州 510180）

2 廣州消化疾病中心（廣東廣州 510180）

3 華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科（廣東廣州 510180）

4 畢節(jié)市第二人民醫(yī)院（貴州畢節(jié) 551700）

乳腺癌是當(dāng)今女性最常見的惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤第一位。柚皮素（naringenin，Nar）又稱柚皮苷，主要來源于天然植物提取物，為常見的中草藥中黃酮類化合物，存在于如柑橘類水果中［1］。柚皮素具有清除自由基、緩解動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤活性等作用。既往的研究顯示，柚皮素在抗炎、清除自由基、抗氧化方面，對過敏性鼻炎、肝損傷、氣道損傷及炎癥反應(yīng)等有效。既往的研究也提示柚皮素可在較高濃度下抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的生長，但具體的作用機(jī)制尚未明確。本文旨在明確柚皮素抑制乳腺癌增殖能力的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人乳腺正常細(xì)胞系MCF-10A和小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1均購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，柚皮素購于西安賽邦生物技術(shù)有限公司。Western Blot化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑盒（雅酶）。Anti-beta-actin購于Proteintech公司，Anti-LCI和Anti-Beclin1購于Abcam公司，Mouse Anti-Human，Rabbit Anti-Human購于CST公司。

1.2 方法

按照20、40、80 和120 μmol/L 4個(gè)濃度利用PBS制備柚皮素溶劑。通過CCK-8、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測柚皮素對乳腺癌細(xì)胞的增殖作用，吸去培養(yǎng)皿細(xì)胞上清液，用PBS將細(xì)胞洗一遍后，加入適量胰酶將細(xì)胞消化下來，加入結(jié)晶紫染液染色15 min以上，吸去結(jié)晶紫染液，用清水輕輕洗凈殘余染色液，放于空氣中自然干燥后，計(jì)數(shù)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測柚皮素對乳腺癌細(xì)胞的凋亡作用，首先觀察細(xì)胞是否處于對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按4.0×105細(xì)胞的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。本實(shí)驗(yàn)設(shè)的分組包括：對照組和柚皮素共2組；孵育 30 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。建立乳腺癌BALB/c小鼠移植瘤模型，對照組和柚皮素共2組，每組6只BALB/c小鼠。并以腹腔注射方式以柚皮素作用于模型小鼠，探討柚皮素的體內(nèi)抗腫瘤作用。按2.0×106細(xì)胞的密度接種于BALB/c 鼠皮下。待移植瘤直徑達(dá)5 mm后隨機(jī)分為對照組和柚皮素干預(yù)組共2組。對照組和柚皮素組每天分別腹腔注射PBS和終濃度為40 mg/kg的柚皮素PBS溶劑。待移植瘤直徑超過15 mm時(shí)停止給藥，麻醉后行頸椎脫臼處死小鼠，取移植瘤稱重，并計(jì)算腫瘤體積，繪制生長曲線，腫瘤體積（V /mm3）=長×寬×寬/2。通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測自噬相關(guān)基因，探討柚皮素對乳腺癌細(xì)胞自噬的影響。本研究方案通過廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理批件號(hào)：K-2019-182-01）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS 17.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中的計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 柚皮素對乳腺癌細(xì)胞（MCF-7、4T1）的抑制作用

通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測了不同濃度不同時(shí)間柚皮素對乳腺癌細(xì)胞（MCF-7、4T1）和乳腺正常細(xì)胞（MCF-10A）的增殖抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柚皮素對檢測的2種乳腺癌細(xì)胞（MCF-7、4T1）均存在明顯的增殖抑制作用，隨著藥物濃度的增加，增殖抑制作用增強(qiáng)，最佳的濃度為80～120 μmol/L。柚皮素對乳腺正常細(xì)胞系MCF-10A的增殖抑制不明顯。故此，80 μmol/L濃度柚皮素為最佳作用濃度。見如圖1。

圖1 柚皮素對乳腺癌細(xì)胞和乳腺正常細(xì)胞增殖活力的影響（*P ＜0.001）

2.2 柚皮素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡

經(jīng)柚皮素處理后，MCF-7和4T1乳腺癌細(xì)胞株平板克隆能力下降（P＜0.001）見圖2，可觀察到80 μmol/L效果最佳。選取80 μmol/L為凋亡實(shí)驗(yàn)的觀察濃度，經(jīng)80 μmol/L柚皮素處理后，MCF-7和4T1乳腺癌細(xì)胞株出現(xiàn)明顯的凋亡（P＜0.001）。見圖3。

圖2 柚皮素處理后，乳腺癌細(xì)胞平板克隆能力下降（***P ＜0.001）

圖3 柚皮素處理后，乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡（***P ＜0.001）

2.3 柚皮素對小鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，并可促進(jìn)其壞死

使用4T1細(xì)胞在Bablc小鼠上構(gòu)建了移植瘤模型，待腫瘤生長至5 mm×5 mm時(shí)，使用80 μmol/L的柚皮素處理。結(jié)果顯示：柚皮素處理后，移植瘤生長速度明顯慢于對照組，質(zhì)量和腫瘤體積均小于對照組。病理HE染色結(jié)果提示：柚皮素處理組腫瘤組織出現(xiàn)明顯的壞死（P＜0.001）。見圖4。

圖4 柚皮素可明顯抑制4T1 乳腺癌細(xì)胞小鼠移植瘤的生長（**P ＜0.01，***P ＜0.001）

2.4 柚皮素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬

自噬相關(guān)基因的表達(dá)檢測結(jié)果中，經(jīng)80 μmol/L柚皮素處理后，4T1乳腺癌細(xì)胞發(fā)生了明顯的自噬。經(jīng)80 μmol/L柚皮素處理后，4T1乳腺癌細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin1、ATG5、HIF-1α、BAX和Bcl-2出現(xiàn)明顯增加（P＜0.01），乳腺癌細(xì)胞發(fā)生了明顯的自噬（見圖5）。

圖5 柚皮素處理后，乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的自噬（**P ＜0.01，***P ＜0.001）

3 討 論

柚皮素是存在于天然植物柑橘類水果中的類黃酮［1］，其已被證明可通過如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、減少血管生成和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等多種機(jī)制來抑制乳腺癌的生長，但具體的作用機(jī)制尚未明確。植物化學(xué)物質(zhì)因其安全性和成本效益而受到廣泛關(guān)注。其中，來自柑橘屬水果的柚皮素被認(rèn)為是極具有潛力的抗癌新興化合物。柚皮素是一種疏水性分子，分子量為272.25 Da，分子式為C15H12O5，它是柚皮苷水解的衍生物，主要以糖苷配基的形式存在，但也存在糖基化和新橙皮苷形式。作為一種無色無味的黃烷酮（一種類黃酮），柚皮素大量存在于柑橘類水果中，如葡萄柚和橙子。

在動(dòng)物模型和人體研究中發(fā)現(xiàn)，柚皮素通過消化道吸收后，主要分布在胃腸道、肝臟、腎臟、肺和氣管中。在柑橘類食物或者口服給藥后，柚皮苷被口腔和小腸的腸道微生物群水解為柚皮素。柚皮素被吸收后通過Ⅰ期和Ⅱ期代謝反應(yīng)代謝為葡糖苷酸和硫酸鹽代謝物。代謝物和未吸收的類黃酮被微生物進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生酚類分解代謝物。該代謝物在動(dòng)物和人類的尿液和糞便樣本中均有檢出［2］。

柚皮素因其具有與雌激素17β-雌二醇甾體核中的多酚環(huán)相似的結(jié)構(gòu)而被稱為植物雌激素，可以與雌激素受體，特別是雌激素受體-α結(jié)合，并與 17β-雌二醇競爭與雌激素受體的結(jié)合［3］。因此柚皮素對雌激素受體陽性或陰性乳腺癌細(xì)胞均具有抑制作用。另一項(xiàng)研究中，柚皮素作為部分激動(dòng)劑（在完全激動(dòng)劑如雌二醇或染料木素存在的情況下）在雌激素受體陰性的乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231）中發(fā)揮競爭性拮抗作用［4］。柚皮素還能通過非雌激素依賴途徑抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2 磷酸化并改變雌激素受體α 定位。此外柚皮素還能有效調(diào)節(jié)循環(huán)中雌激素的代謝。研究發(fā)現(xiàn)，通過誘導(dǎo)慢性心理壓力，會(huì)增加體循環(huán)雌二醇濃度并促進(jìn)乳腺癌生長。在雌性小鼠模型中，柚皮素降低了心理應(yīng)激誘導(dǎo)的雌二醇水平，從而限制了乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移［5］。

氧化應(yīng)激指細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制不足以清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）或產(chǎn)生過量ROS的情況。因?yàn)檠趸瘧?yīng)激促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展，所以ROS是潛在的致癌物。乳腺癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生高水平的ROS，導(dǎo)致基礎(chǔ)氧化應(yīng)激增加。然而越來越多的研究表明柚皮素對乳腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)有兩面性。一方面，柚皮素作為眾所周知的抗氧化劑可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，即中和ROS 的破壞作用［6］。另一方面，在高濃度下，類黃酮會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用。類黃酮的細(xì)胞毒性有幾種機(jī)制，包括抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶、激酶及其促氧化作用。ROS作為調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵信號(hào)分子其促氧化作用是這些化合物的選擇性抗增殖活性的原因。已發(fā)現(xiàn)柚皮素具有促氧化潛力，通過誘導(dǎo) ROS 生成導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡［7］。

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡機(jī)制受損會(huì)導(dǎo)致基因組受損的細(xì)胞存活下來，從而使其不受控制地增殖并引發(fā)癌變。 因此，能選擇性抑制細(xì)胞增殖或阻斷這種異常的死亡信號(hào)的化合物是治療該癌癥的候選藥物。研究表明，柚皮素通過內(nèi)在（線粒體）和外在途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)在途徑，柚皮素通過上調(diào)促凋亡基因如 P18、P21、p38、Bax和Bcl-2 的表達(dá)，刺激線粒體細(xì)胞色素c 釋放，形成凋亡小體，從而增強(qiáng)半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶caspase-9 表達(dá)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。同時(shí)，柚皮素能夠下調(diào)抗凋亡細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 CDK 7 和 CDK 6的表達(dá)。通過調(diào)節(jié)癌癥中細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子Bax/Bcl-2 比例，加強(qiáng)促凋亡蛋白的表達(dá)。研究表明，柚皮素與 CDK6 強(qiáng)烈結(jié)合，從而降低肺癌細(xì)胞（A549）和乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）中形成集落的能力，控制腫瘤發(fā)生和進(jìn)展［3-4］。外在途經(jīng)，柚皮素可以通過激活腫瘤壞死因子（INF）相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）及其受體DR5（TRAIL/DR5）途徑誘導(dǎo)凋亡途徑，從而導(dǎo)致caspase-8、caspase-3、caspase-9 增加聚ADP-核糖聚合酶PARP 的表達(dá)并增強(qiáng)細(xì)胞裂解，這提示細(xì)胞進(jìn)入凋亡前階段［8］。柚皮素另一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的機(jī)制為調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶MAPK 家族成員（p38、ASK1、MAPK）和 p53的表達(dá)，它們在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起重要作用。此外，柚皮素以劑量和時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)三陰性人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MR-231）DNA片段化和減少核因子-κB與 DNA 結(jié)合，從而將細(xì)胞周期停滯在G0/G1期和G2期，抑制乳腺癌細(xì)胞的生長［9］。

由于腫瘤的生長需要大量的營養(yǎng)，因此新血管生成是腫瘤發(fā)展所必需的。包括乳腺癌在內(nèi)的許多實(shí)體瘤通過產(chǎn)生血管生成因子，主要是血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）來誘導(dǎo)血管增殖。在體外模型中，柚皮素可抑制人乳腺癌細(xì)胞釋放VEGF。在人內(nèi)皮細(xì)胞模型中，柚皮素治療抑制了體外血管生成，柚皮素還降低了內(nèi)皮細(xì)胞中免疫球蛋白超家族細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)以及單核細(xì)胞黏附，表明它在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能方面具有潛在作用。柚皮素同時(shí)作為雌激素受體α的抑制劑，以 VEGF/激酶插入域受體通路依賴性方式阻礙血管生成和腫瘤細(xì)胞存活。研究還表明，柚皮素能有效抑制促血管生成的炎癥細(xì)胞因子。此外，小雞絨毛尿囊膜測定表明，柚皮素還可以抑制體內(nèi)生理性血管生成［10］。許多研究已經(jīng)證明柚皮素對乳腺癌的抗癌效果，因此它代表了一種極具潛力的癌癥治療生物活性化合物。

腫瘤細(xì)胞能夠通過侵入過程侵入局部組織，并從它們的原始部位遷移到遠(yuǎn)處的部位，在那里它們通過轉(zhuǎn)移過程形成新的腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素可通過誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡、caspase 刺激、G2/M 期細(xì)胞周期停滯和抑制來抑制人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）轉(zhuǎn)移能力［11］。柚皮素還通過抑制蛋白激酶C磷酸化或減少轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）從跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)的運(yùn)輸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) TGF-β1 的積累，從而抑制乳腺癌的肺部遷移。在黑色素瘤和肺癌小鼠模型中觀察到，柚皮素還可靶向TGFβ-Smad-MMP2通路抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［12］。

許多研究已經(jīng)證明柚皮素對乳腺癌的抗癌效果，因此它代表了一種極具潛力的癌癥治療生物活性化合物。在這種背景下，由柚皮素和常用抗癌藥物組成的聯(lián)合療法應(yīng)運(yùn)而生，作為一種新的治療策略，柚皮素和常用抗癌藥物的聯(lián)合治療顯示出兩者單一療法所不具備的協(xié)同作用。各種研究已經(jīng)證實(shí)，包括柚皮素在內(nèi)的聯(lián)合療法在體外對不同類型乳腺癌具有很強(qiáng)的抗癌活性。使用他莫昔芬等藥物靶向雌激素受體是一種常見的治療方法，但長期使用會(huì)導(dǎo)致耐藥性。與他莫昔芬聯(lián)合使用時(shí)，柚皮素被發(fā)現(xiàn)比單獨(dú)使用任何一種治療更有效地抑制乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的活力。他莫昔芬和柚皮素的聯(lián)合用藥能夠調(diào)節(jié)四種雌激素受體亞型，通過上調(diào) ERβ 表達(dá)并下調(diào) ER66、ER36和GPR30的基因轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，即使在沒有雌激素的情況，柚皮素也能有效抑制乳腺癌細(xì)胞中激活的磷酸肌醇3-激酶和MAPK 增殖通路，從而阻斷雌激素受體的激活抑制了乳腺癌細(xì)胞增殖，這與改善乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)［13］。此外，使用納米膠束藥物遞送載體遞送他莫昔芬和柚皮素可能是聯(lián)合治療乳腺癌的有效策略，因?yàn)樵摲椒ㄓ行岣吡怂幬飻z取和縮小腫瘤大小。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)固定環(huán)磷酰胺用量，乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）活力會(huì)以柚皮素劑量依賴性方式顯著降低。與單獨(dú)使用柚皮素治療相比，聯(lián)合治療還著減少了乳腺癌數(shù)量并顯著增加了凋亡蛋白Bax的表達(dá)。阿霉素類的化療藥物是乳腺癌化療藥物的基石，然而，阿霉素的長期使用會(huì)導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換并通過片狀偽足形成開始侵襲，這是轉(zhuǎn)移過程的第一階段。為降低阿霉素的不良影響，于是嘗試柚皮素與阿霉素聯(lián)合用藥，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥治療不僅增加了乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）毒性還抑制了這些細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力［14］。另一研究發(fā)現(xiàn)，與單用阿霉素相比，柚皮素聯(lián)合二甲雙胍和阿霉素在三陰性乳腺癌中無論在體內(nèi)還是體外都具有更顯著的細(xì)胞毒性作用。柚皮素與這兩種化學(xué)治療劑的聯(lián)合治療顯著減少腫瘤體積，伴有細(xì)胞增殖減弱和明顯的細(xì)胞壞死。這三種化合物的較小劑量可導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α和白介素-1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生更顯著增加［15］。

本實(shí)驗(yàn)通過研究柚皮素對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，探討柚皮素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。柚皮素可明顯抑制小鼠移植瘤體積增加，經(jīng)柚皮素處理后，乳腺癌細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin1、BAX、ATG5、HIF-1α和Bcl-2出現(xiàn)明顯增加。通過應(yīng)用柚皮素，乳腺癌細(xì)胞發(fā)生了明顯的自噬，柚皮素能夠通過多種機(jī)制刺激乳腺癌中來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，延緩腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。對于柚皮素可否應(yīng)用于臨床來治療乳腺癌仍待進(jìn)一步研究。