清胰Ⅱ號對牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)的急性胰腺炎大鼠的保護作用

蔡治方，彭慈軍，兌丹華，傲 宇，蘭天罡

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科貴州遵義563000

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種因胰腺消化酶異常激活引起的急性炎癥性疾病［1］。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)中藥方劑清胰Ⅱ號可能通過多途徑、多靶點對AP起到良好的治療作用。前期研究［2］發(fā)現(xiàn)，減少ROS可抑制ROS/JNK信號通路的激活，下調(diào)促炎癥因子的表達，減輕人體胰腺組織的損傷。該研究采用清胰Ⅱ號治療?；悄懰徕c誘導(dǎo)的AP大鼠，探討其具體的保護作用機制，為防治AP提供參考。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器 ?；悄懰徕c購自上海笛柏生物科技有限公司;IL-6、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA試劑盒均購自上海遠慕生物科技有限公司;淀粉酶、ROS、SOD、CAT、MDA檢測試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;JNK檢測試劑盒購自長春百奧生物科技有限公司。主要儀器有Leica DM2500顯微鏡、ELx800酶標儀、小型垂直電泳儀及電泳槽、全能型蛋白快速轉(zhuǎn)膜儀、核酸/蛋白質(zhì)含量測定儀、高速冷凍離心機。

1．2 動物分組與模型制備 清潔級6～8周齡雄性SD大鼠36只，體重(230±33)g，購于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。大鼠在無菌、室溫25～27℃、濕度45%的安靜空間中飼養(yǎng)。將36只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和治療組3組，每組12只。造模前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)前12 h禁食，不禁水。對模型組與治療組大鼠實施造模手術(shù)，水合氯醛麻醉，上腹切口入腹，用小動脈夾于肝門側(cè)暫時夾閉膽管;用胰島素注射針由十二指腸前壁斜行進針，經(jīng)乳頭部插入膽胰管，以0．1 mL/min的速度勻速向膽胰管內(nèi)注入30 g/L牛磺膽酸鈉(1 mL/kg);注藥后拔出針頭，關(guān)腹。麻醉蘇醒后，正常組與模型組按0．01 mL/kg灌胃生理鹽水，治療組用250 g/L清胰Ⅱ號方劑按10 mL/kg灌胃，6 h一次，共灌胃4次［1］。最后一次灌胃6 h后用水合氯醛麻醉并處死大鼠，采集血液并留取胰腺、腸組織。

1．3 胰腺組織病理學(xué)觀察 取胰腺組織制作切片并行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，參照Schimidt評分標準根據(jù)水腫、腺細胞壞死、炎癥和血管周圍浸潤情況等進行評分［1］。

1．4 血漿淀粉酶活性測定 將采集的血液及時抗凝處理后，離心機離心，取上清液。按照試劑盒說明書操作，以正常組為100%，測定模型組和治療組的血漿淀粉酶活性。

1．5 血漿IL-6、MCP-1含量測定 參照試劑盒說明書分別測定大鼠血漿中IL-6、MCP-1含量，正常組結(jié)果記為0。

1．6 胰腺組織中ROS、SOD、CAT和MDA水平測定 取胰腺組織制成勻漿，離心后取上清，使用雙氫羅丹明-123試劑盒檢測ROS，用熒光強度代表ROS水平;采用氧化酶反應(yīng)法檢測SOD，鉬酸銨終止法檢測CAT，硫代巴比妥酸法檢測MDA;具體方法均遵循試劑盒說明書。

1．7 腸菌檢測 取3組的盲腸、回腸及結(jié)腸各1 cm，稱量，用LB液態(tài)培養(yǎng)基沖洗腸壁，進行大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌的培養(yǎng)，48 h后進行細菌計數(shù)［4-6］。

1．8 胰腺組織中JNK蛋白表達的檢測 取胰腺組織剪碎后，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清液，檢測蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混勻后，煮沸5 min，上樣孔中加入40μL/孔，連接電泳儀(100 V，2 h);50 mA、4℃、半干法轉(zhuǎn)膜60 min;50 g/L脫脂奶粉液室溫封閉90 min，加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃孵育過夜;加入1∶2 000稀釋的二抗，37℃孵育90 min。滴加顯色液，曝光，激光成像系統(tǒng)拍照掃描，以JNK與GAPDH條帶灰度值的比值表示JNK蛋白相對表達量。

1．9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22．0進行數(shù)據(jù)分析。組間血漿淀粉酶活性及血漿中IL-6、MCP-1含量的比較采用兩獨立樣本的t檢驗;胰腺組織病理學(xué)評分，胰腺組織中 ROS、SOD、CAT、MDA 水平，腸道菌群，JNK蛋白相對表達量的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)大面積胰腺組織損傷，如水腫、出血、腺細胞壞死、炎癥細胞浸潤等。治療組與模型組相比，胰腺組織水腫及炎癥程度皆明顯減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，腺細胞壞死消失。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果(×200)

2．2 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)評分與血漿淀粉酶活性的比較 與正常組相比，模型組及治療組大鼠組織病理學(xué)評分、血漿淀粉酶活性升高;與模型組相比，治療組血漿淀粉酶活性下降。見表1。

表1 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)評分與血漿淀粉酶活性的比較

2．3 各組大鼠血漿中IL-6、MCP-1含量的比較與模型組比較，治療組血漿中IL-6、MCP-1含量降低。見表2。

表2 各組大鼠血漿中IL-6、MCP-1含量的比較 mg/L

2．4 各組大鼠胰腺組織中ROS、SOD、CAT、MDA水平比較 與正常組比較，模型組大鼠胰腺組織中ROS、MDA水平升高，SOD、CAT水平降低;與模型組比較，治療組 ROS、MDA水平降低，SOD、CAT水平升高。見表3。

2．5 各組大鼠腸道菌群的變化 與正常組相比，模型組大鼠3種細菌數(shù)量均增加;與模型組相比，治療組3種細菌均減少。見表4。

表3 各組胰腺組織中ROS、SOD、CAT、MDA水平比較

表4 各組大鼠腸道菌群的比較 cfu/mg

2．6 各組大鼠胰腺組織中JNK蛋白的表達 正常組、模型組、治療組大鼠胰腺組織中JNK蛋白的相對表達量分別為(0．04 ±0．01)、(0．72 ±0．24)、(0．46 ±0．15)(F=52．848，P ＜0．001)。與正常組比較，模型組JNK蛋白表達水平增加(P＜0．05);與模型組比較，治療組JNK蛋白表達水平降低(P＜0．05)，見圖2。

圖2 各組大鼠胰腺組織中JNK蛋白的表達

3 討論

AP是嚴重威脅人類健康的重大疾病，隨著我國民眾生活節(jié)律和飲食習(xí)慣的變化，AP發(fā)病率呈現(xiàn)增高的趨勢［7-11］。因此，尋找新的有效治療 AP的藥物，對于控制該病有著重要的臨床意義。清胰Ⅱ號源自《傷寒論》，是由中醫(yī)經(jīng)典方大承氣湯加味而成，更是由八味對癥的藥用植物和礦物加工而成，具有疏肝利膽、通腑泄熱、緩急止痛的功效，是治療AP的基礎(chǔ)方劑。清胰Ⅱ號中的有效成分在AP治療中均對應(yīng)著多個不同的靶點，許多靶點又同時受到ROS/JNK基因的調(diào)控［12］。本研究結(jié)果顯示:IL-6及MCP-1水平存在正常組＜治療組＜模型組的關(guān)系，說明清胰Ⅱ號可減輕炎癥反應(yīng)。李敏等［13］也曾指出，清胰Ⅱ號可抑制AP小鼠的炎癥反應(yīng)。

研究［14］發(fā)現(xiàn)AP組織中氧自由基增多，表明AP發(fā)生過程中存在明顯的過氧化。氧自由基可以與體內(nèi)各種組織成分發(fā)生反應(yīng)，影響細胞的功能和代謝，破壞細胞膜穩(wěn)定性，使胰腺細胞溶酶體釋放，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)被破壞，引發(fā)胰腺水腫、出血、變性和壞死。本實驗結(jié)果顯示:與模型組相比，治療組胰腺組織中ROS、MDA水平明顯降低，CAT、SOD水平明顯升高，說明清胰Ⅱ號可提高抗氧化應(yīng)激能力、清除ROS。研究［15］發(fā)現(xiàn)，多種促炎細胞因子可激活ROS/JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一經(jīng)激活，胞漿中的JNK會迅速移位到細胞核，使其磷酸化。本實驗結(jié)果顯示:與模型組相比，治療組大鼠的胰腺組織病理學(xué)評分、腸道細菌數(shù)量、血漿淀粉酶活性、JNK蛋白均明顯降低，證實清胰Ⅱ號可明顯緩解AP病理損傷程度。

綜上所述，清胰Ⅱ號治療后AP大鼠胰腺損傷程度減輕，說明清胰Ⅱ號可能通過減少ROS的產(chǎn)生抑制JNK信號通路的激活，隨之阻斷胰腺組織炎癥因子的生成，起到拮抗AP的作用。