程序性細(xì)胞死亡因子4過表達對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響

潘學(xué)洪，李愛武，李新華

1)濰坊市益都中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容科山東濰坊262500 2)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院小兒外科濟南250012 3)山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院糖尿病醫(yī)院檢驗科濟南250000

成纖維細(xì)胞是形成瘢痕的重要原因［1］。程序性細(xì)胞死亡因子 4(programmed cell death 4，PDCD4)是一種細(xì)胞死亡因子，參與調(diào)控細(xì)胞生長過程，在骨骼肌、心、肺等組織中均有表達［2］。研究［3］顯示，PDCD4與成纖維細(xì)胞的凋亡、分化、膠原合成等有關(guān)，其在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達水平低于正常皮膚成纖維細(xì)胞。本研究分離培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法過表達PDCD4，探討PDCD4在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、凋亡中的作用，為研究病理性瘢痕的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 增生性瘢痕組織標(biāo)本取自濰坊市益都中心醫(yī)院，標(biāo)本采集已獲患者知情同意，患者術(shù)前未接受過治療。pEGFP-PDCD4真核過表達載體及空載體pEGFP由濰坊市益都中心醫(yī)院整形外科實驗室構(gòu)建保存，Lipofectamine2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購自美國Thermo公司，PDCD4、β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，熒光定量PCR試劑盒購自美國Biomiga公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Sigma公司，PDCD4、PTEN、Bax、Bcl-2 多克隆抗體均購自美國Abcam公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1．2 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取增生性瘢痕組織，用含青鏈霉素的PBS洗滌3次，用眼科剪剔除皮下組織和表皮組織，再用含青鏈霉素的PBS 洗滌3 次，剪碎(大小約0．5 mm3)，加入2．5 g/L的胰蛋白酶，4℃消化9 h。取消化后的組織塊接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊朝下，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，取出培養(yǎng)瓶，翻轉(zhuǎn)，使組織塊朝上，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間每隔3 d換液一次，待細(xì)胞匯合形成集落后，用2．5 g/L的胰蛋白酶消化傳代。分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)角蛋白19抗體染色陰性，波形蛋白抗體染色陽性，確認(rèn)為成纖維細(xì)胞。取第4代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1．3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將增生性瘢痕成纖維細(xì)胞接種到6孔板中，每孔4×105個細(xì)胞，培養(yǎng)1 d后，進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將Opti-MEM預(yù)熱1 h后加入上述細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1．5 mL。再將用 Opti-MEM稀釋好的Lipofectamine2000和pEGFP-PDCD4、pEGFP分別混合后室溫孵育20 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入500μL，孵育6 h，更換為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用于后續(xù)實驗。將轉(zhuǎn)染pEGFP-PDCD4和pEGFP后的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞記為pEGFP-PDCD4組和pEGFP組，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對照組。

1．4 qRT-PCR檢測PDCD4水平 3組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，加入1 mL Trizol提取RNA，檢測純度后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用熒光定量PCR檢測PDCD4水平。β-actin上游引物為5’-CTGGGACGACATGGA CAAAA-3’，下游引物為5’-AAGGAAGGCTGGAAG TGTGC-3’。PDCD 4上游引物為5’-GGCAAGGA GGGACAGAAA-3’，下游引物為 5’-CCCAAAGCA CAGTATCTCAACA-3’。PCR反應(yīng)體系共20μL，包括10．0μL SYBR Primer Ex Taq TM Ⅱ(2×) ，上、下游引物各 1．0 μL，4．0 μL cDNA 樣本混合液和4．0μL無RNase dH2O。擴增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算PDCD4 mRNA的相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

1．5 W estern blot法檢測 PDCD4、PTEN、Bax、Bcl-2水平 3組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，4℃，12 000×g離心5 min，吸取蛋白上清液，用BCA法對蛋白定量。取蛋白樣品加入等體積的上樣緩沖液，100℃孵育5 min。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。麗春紅染色5 min，加入50 g/L脫脂奶粉37℃平搖2 min。加入按1∶600 稀釋的 PDCD4、PTEN、Bax、Bcl-2多克隆抗體，4℃反應(yīng)過夜后，加入按1∶3 000稀釋的二抗，37℃孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光，顯影，定影。用掃描儀掃描圖片，Quantity one分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白表達水平。實驗重復(fù)3次。

1．6 生長曲線測定 將3組細(xì)胞接種到24孔板中，每孔104個細(xì)胞，分別在第 1、2、3、4、5 天用 2．5 g/L的胰蛋白酶消化，臺盼藍染色分析活細(xì)胞數(shù)量，以測定時間為橫軸，以每mL含有的細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1．7 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 將3組細(xì)胞接種到24孔板中，每孔2×104個細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，每孔加入pH 7．4的 MTT溶液20μL，37℃孵育4 h后，吸棄上清液，加入150μL的二甲基亞砜溶液，振蕩反應(yīng)10 min，觀察到藍紫色結(jié)晶溶解后，檢測570 nm波長處的光密度值，代表細(xì)胞增殖活性。實驗重復(fù)3次。

1．8 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 3組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，制作細(xì)胞爬片，用PBS洗滌3次，加入體積分?jǐn)?shù)0．2%的 TritonX-100處理5 min后，用 PBS洗滌2次，加入20 mg/L蛋白酶K溶液，室溫下孵育30 min。于含體積分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白、20%胎牛血清的TBS中，室溫條件下孵育30 min，用PBS洗滌2次，加入FITC標(biāo)記的TUNEL溶液，置于濕盒內(nèi)37℃孵育60 min。PBS洗滌2次后，在顯微鏡下觀察，選取5個視野，先用200倍的暗視野計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，后用熒光顯微鏡觀察陽性細(xì)胞數(shù)目，計算細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1．9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21．0處理數(shù)據(jù)，3組間PDCD4表達水平、光密度值、凋亡率以及PTEN、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 3組細(xì)胞PDCD4表達水平的比較 結(jié)果見圖1和表1。與空白對照組、pEGFP組相比，pEGFPPDCD4組細(xì)胞PDCD4的表達水平升高。

圖1 3組細(xì)胞PDCD4表達水平的比較

表1 3組細(xì)胞PDCD4表達水平的比較(n=3)

2．2 3組細(xì)胞生長曲線比較 結(jié)果見圖2。與空白對照組、pEGFP組相比，pEGFP-PDCD4組細(xì)胞生長速度降低。

2．3 3組細(xì)胞增殖活性和凋亡率比較 結(jié)果見表2。與空白對照組、pEGFP組相比，pEGFP-PDCD4組細(xì)胞光密度值降低，凋亡率升高。

2．4 3組細(xì)胞 PTEN、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較 結(jié)果見圖3和表3。與空白對照組、pEGFP組相比，pEGFP-PDCD4組細(xì)胞PTEN、Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低。

圖2 細(xì)胞生長曲線

表2 3組細(xì)胞增殖活性和凋亡率比較(n=3)

圖3 3組細(xì)胞PTEN、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較

表3 3組細(xì)胞PTEN、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較(n=3)

3 討論

PDCD4位于10q27染色體上，其編碼的蛋白能夠與脯氨酸激酶、蛋白激酶C等結(jié)合，含有多個磷酸化位點，由469個氨基酸組成，在其氨基端有兩個MA3螺旋結(jié)構(gòu)域，能夠與真核細(xì)胞中翻譯起始因子eIF4A結(jié)合，阻礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和核糖體復(fù)合物的形成，發(fā)揮促進細(xì)胞凋亡的作用［4-6］。研究［7-8］顯示，PDCD4不僅參與機體正常的生理過程，還與癌癥、心肌病、糖尿病、病理性瘢痕形成等有關(guān)。彭燕［9］在研究miR-21對病理性瘢痕成纖維細(xì)胞生長中的作用時發(fā)現(xiàn)，PDCD4在病理性瘢痕細(xì)胞中表達下調(diào)，并且可能參與成纖維細(xì)胞的生長過程。后續(xù)的研究［10-11］發(fā)現(xiàn)，miR-21表達下調(diào)后，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞PDCD4表達水平升高，增殖受抑。上述研究表明，PDCD4可能參與調(diào)控病理性瘢痕的形成，并且與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)。

本研究首先體外分離培養(yǎng)了人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染PDCD4后，經(jīng)qRT-PCR和Western blot法驗證成功構(gòu)建了PDCD4過表達的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。細(xì)胞生長曲線顯示，過表達PDCD4的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞從第3天開始活細(xì)胞的數(shù)量較空白對照組和pEGFP組降低，增殖活性降低，說明PDCD4抑制了增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，這與之前的研究［10-11］結(jié)果一致。

病理性瘢痕組織的形成除了與成纖維細(xì)胞過度增殖有關(guān)，還與成纖維細(xì)胞凋亡減少有關(guān)。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一個主動過程，是受多種基因嚴(yán)格調(diào)控的程序性死亡過程，與細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白有關(guān)［12-13］。Bcl-2蛋白家族參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，根據(jù)其作用不同可以分為抗凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而 Bax是一種促凋亡蛋白［14］。PTEN編碼的蛋白具有雙重的磷酸酶活性，能夠與細(xì)胞內(nèi)多種信號通路交叉作用，調(diào)控細(xì)胞的生長、黏附、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程［15-16］。研究［9，17］顯示，在病理性瘢痕組織中，PTEN表達下調(diào)，并且能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，而PDCD4也在病理性瘢痕組織中表達下調(diào)，二者之間可能存在一定的作用。本研究結(jié)果顯示，PDCD4過表達的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中Bax和PTEN表達水平升高，Bcl-2表達水平下降，說明PDCD4可能通過作用于PTEN影響細(xì)胞凋亡過程，而兩者的相互調(diào)節(jié)作用仍然需要在后續(xù)實驗中驗證。

綜上，PDCD4過表達可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機制可能與上調(diào)細(xì)胞中PTEN、Bax表達，下調(diào)Bcl-2表達有關(guān)。本研究結(jié)果對于探討病理性瘢痕的發(fā)病機制具有重要意義，為繼續(xù)探討PDCD4在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長中的作用奠定了基礎(chǔ)。