生長分化因子15-siRNA對人垂體瘤HPAs細胞增殖、侵襲及NF-κB信號通路的影響

吳丹榮，李 紅，王 超，高方友

1)貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝病科貴陽550004 2)貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科貴陽550002

垂體瘤是一種顱內(nèi)良性腫瘤，前葉的腺瘤是較為常見的類型，而侵襲性垂體腺瘤約占垂體腺瘤的10%［1］，具有術(shù)后效果差和復發(fā)率高等特點。生長分化 因 子 15(growth differentiation factor 15，GDF15)又稱巨噬細胞抑制因子、胎盤骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胎盤轉(zhuǎn)化生長因子和前列腺衍生因子，是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，在調(diào)節(jié)組織發(fā)育、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用［2-3］。大量研究［4-6］證實，GDF15在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌和乳腺癌等多種腫瘤組織或細胞中異常表達，在細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。近年來，有研究［7］發(fā)現(xiàn)GDF15在垂體腺瘤中高表達，且與垂體瘤侵襲性有關(guān)，但其機制并不清楚。本研究將GDF15-siRNA轉(zhuǎn)染至人泌乳素型垂體瘤細胞HPAs中干擾GDF15表達，觀察其對垂體瘤細胞增殖和侵襲的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，Lipofectamine2000和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司。MTT試劑、二甲基亞砜和胰蛋白酶購于美國Sigma公司。VEGF和MMP-9抗體購于武漢博士德公司，β-actin、NF-κB p65 和 p-NF-κB p65 抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標記的二抗購于上?？党缮锕こ逃邢薰尽DF 15-siRNA(上游5’-CUCAGAGUUGCACUCC GAATT-3’，下游5’-UUCG-GAGUGCAACUCUG AGTT-3’)和陰性對照(NC)-siRNA(上游 5’-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游 5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’)購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。BCA蛋白定量檢測試劑盒和細胞裂解液購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。PVDF膜和Transwell小室購于美國Millpore公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于加拿大Fermentas公司，ECL試劑購于美國Pierce公司。紫外分光光度計購于美國Pharmacia公司，酶聯(lián)免疫檢測儀和凝膠成像系統(tǒng)購于Bio-Rad公司，PCR儀購于美國ABI公司，CO2細胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司。

1．2 細胞培養(yǎng) 垂體瘤細胞株HPAs購于中國科學院上海細胞庫。將解凍復蘇后的細胞接種至加有DMEM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞長至80%融合時，加入2．5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1．3 細胞分組及轉(zhuǎn)染 實驗分為對照組(未轉(zhuǎn)染)、GDF15-siRNA組(轉(zhuǎn)染 GDF15-siRNA)和 NC-siRNA組(轉(zhuǎn)染NC-siRNA)，每組設(shè)置3個復孔。取生長良好的對數(shù)生長期HPAs細胞，以每孔2．5×105個細胞接種至6孔板上，常規(guī)培養(yǎng)至細胞融合度達70%以上時進行轉(zhuǎn)染。以無血清DMEM培養(yǎng)基分別稀釋siRNA和Lipofectamine2000后，混和制成siRNA/脂質(zhì)體復合物。參照 Lipofectamine2000說明書將siRNA/脂質(zhì)體復合物按照實驗分組轉(zhuǎn)染至垂體瘤細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后收集細胞，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測GDF15 mRNA和蛋白，分析轉(zhuǎn)染效果。

1．4 細胞增殖率檢測 將對數(shù)生長期的HPAs細胞以每孔104個接種至96孔板上，培養(yǎng)24 h。參照1．3中的分組方法進行處理。每組設(shè)置4個復孔，并以不含細胞的培養(yǎng)基作為空白組。分別在培養(yǎng)24、48和72 h后，加入MTT 20μL，4 h后終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基后，加入二甲基亞砜150μL至MTT結(jié)晶完全溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處檢測細胞的光密度(OD)值。細胞增殖率=實驗組OD/空白組OD×100%。實驗重復3次。

1．5 細胞侵襲能力檢測 收集轉(zhuǎn)染后的各組細胞，胰蛋白酶消化，以無血清培養(yǎng)基制備密度為103個/mL的細胞懸液。向鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室的上室中加入細胞懸液100μL，下室中加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個復孔。置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室。甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min。以棉簽小心擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞，200倍顯微鏡下選取5個視野，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)。實驗重復3次。

1．6 qRT-PCR檢測GDF15 mRNA的表達 采用Trizol法提取待測細胞的總RNA，并以紫外分光光度計進行濃度及純度的定量。取1μg總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。GDF15上游引物5’-GTTAGCCAAAGACTGCCACTG-3’，下游引物 5’-CCTTGAGCCCATTCCACA-3’，擴增片段大小 105 bp;β-actin 上游引物 5’-GGCGGCAACACCATGTAC CCT-3’，下游引物5’-AGGGGCCGGACTCGTCATAC T-3’，擴增片段大小202 bp;均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計、合成。以2μL cDNA為模板，與10 μLMaster Mix、1μL上游引物、1 μL下游引物和6 μL ddH2O配成20μL的PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:94℃ 預變性6 min;95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算GDF15 mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1．7 W estern blot檢測 GDF15、NF-κB p65、p-NF-κB p65、MMP-9和VEGF蛋白的表達 向待測細胞中加入細胞裂解液抽提總蛋白，并參照BCA蛋白定量檢測試劑盒說明書對所提取的總蛋白進行定量。經(jīng)沸水浴變性后，以每孔總蛋白60μg上樣至SDS-PAGE凝膠孔中行電泳分離。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，采用含50 g/L脫脂奶粉液的TBST封閉液常溫封閉2 h。4℃結(jié)合特異性一抗反應(yīng)24 h，常溫下結(jié)合二抗反應(yīng)2 h。采用ECL發(fā)光顯影后，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并對目的蛋白條帶進行掃描，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值比值表示各目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1．8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22．0進行統(tǒng)計學分析。不同組間GDF15 mRNA表達水平，細胞增殖率，穿膜細胞數(shù)，p-NF-κB p65/NF-κB p65 以及MMP-9、VEGF、GDF15蛋白表達水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準 α =0．05。

2 結(jié)果

2．1 3組細胞中GDF15蛋白和mRNA表達水平的比較 結(jié)果見圖1和表1。NC-siRNA組細胞中GDF15蛋白和mRNA的表達水平較對照組無變化，而GDF15-siRNA組細胞中GDF15蛋白和mRNA的表達水平較對照組降低。

圖1 3組細胞中GDF15蛋白的表達

表1 3組細胞中GDF15蛋白和m RNA相對表達量的比較(n=3)

2．2 3組細胞增殖率的比較 結(jié)果見表2。轉(zhuǎn)染后24、48和72 h，與對照組相比，NC-siRNA組細胞的增殖能力無明顯改變，而GDF15-siRNA組細胞增殖受抑。

2．3 3組細胞侵襲能力的比較 結(jié)果見表2。與對照組相比，NC-siRNA組細胞侵襲能力無明顯改變，而GDF15-siRNA組細胞的侵襲能力受抑。

表2 3組細胞增殖率和穿膜細胞數(shù)的比較(n=3)

2．4 3 組 細 胞 中 p-NF-κB p65/NF-κB p65 和MMP-9、VEGF蛋白表達的比較 結(jié)果見圖2和表3。與對照組相比，NC-siRNA組細胞中NF-κB p65磷酸化水平以及MMP-9、VEGF蛋白的表達無明顯改變，而GDF15-siRNA組細胞中NF-κB p65磷酸化水平和MMP-9、VEGF蛋白的表達均降低。

圖2 3組細胞中p-NF-κB p65、NF-κB p65、MMP-9 和 VEGF 蛋白的表達

表 3 3 組細胞 p-NF-κB p65/NF-κB p65、MMP-9和VEGF蛋白相對表達水平的比較(n=3)

3 討論

GDF15基因位于19p12．1-13．1染色體上，編碼的蛋白可通過多種途徑參與細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究［8］發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清中GDF15水平升高，且其水平與肝臟受累程度以及患者預后關(guān)系密切，可作為大腸癌轉(zhuǎn)移的有效生物標志物;同時，GDF15可通過IGF-1R-FoxM1信號通路激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移［9］。另外，在宮頸癌組織中GDF15表達升高，并且上調(diào)其表達可通過激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路上調(diào)CyclinD1、CyclinE1和下調(diào)p21表達，從而促進腫瘤細胞增殖［10］。有學者［11］發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌組織中GDF15高表達，而沉默其表達可顯著抑制BALB/c裸鼠移植瘤的生長。此外，在肝癌HepG2細胞中GDF15高表達可上調(diào) N-Cadherin、Vimentin、Twist1和下調(diào)E-Cadherin蛋白表達，促進HepG2細胞的存活、侵襲、遷移和血管生成，而用GDF15-shRNA干擾其表達后，HepG2細胞的存活、侵襲、遷移和血管生成均明顯受到抑制［12］。

研究［7］發(fā)現(xiàn)，GDF15在垂體腺瘤組織中表達較高，且與垂體瘤侵襲性相關(guān)。本研究通過GDF15-siRNA轉(zhuǎn)染成功下調(diào)GDF15表達后，垂體瘤HPAs細胞的增殖和侵襲能力均明顯受到抑制，提示GDF15可能在垂體瘤細胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮著促進作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多種信號通路活化的復雜過程，NF-κB信號通路就是其中之一。NF-κB是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB p65是該家族成員中重要的功能性亞單位，磷酸化后可激活NF-κB信號通路，進而調(diào)控免疫相關(guān)受體、細胞因子和黏附分子等，參與包括垂體瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［13］。MMP-9是一種與腫瘤侵襲關(guān)系密切的MMP家族成員，在維持降解和重塑細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡過程中發(fā)揮重要作用;VEGF是血管形成的重要因子，可通過激活相應(yīng)受體增加血管通透性和促進細胞增殖;MMP-9和VEGF均是NF-κB信號通路下游相關(guān)蛋白，在垂體瘤細胞侵襲和增殖等過程中發(fā)揮重要作用［14］。有研究［5］指出，過表達GDF15可通過上調(diào)VEGF、MMP-2和MMP-9促進卵巢癌細胞的生長及侵襲;還可通過上調(diào)NF-κB、MMP-9的表達促進乳腺癌細胞的增殖與侵襲。該研究發(fā)現(xiàn)，GDF15-siRNA能夠明顯抑制HPAs細胞中NF-κB p65的磷酸化和MMP-9、VEGF的表達。提示 GDF15可通過激活 NF-κB信號通路上調(diào)MMP-9和VEGF的表達，進而促進垂體瘤細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，GDF15在垂體瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，GDF15-siRNA可通過抑制NF-κB信號通路的活化下調(diào)MMP-9和VEGF表達，進而發(fā)揮抑制垂體瘤細胞增殖和侵襲的作用。