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    視黃醇對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的抑制作用

    2019-09-25 04:23:19盧勁曄顧蓓蓓馬卉
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年6期
    關(guān)鍵詞:視黃醇

    盧勁曄 顧蓓蓓 馬卉

    摘要:為探討視黃醇對(duì)大腸桿菌誘發(fā)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響,原代培養(yǎng)大鼠乳腺上皮細(xì)胞,試驗(yàn)組預(yù)先經(jīng)視黃醇處理24 h后,對(duì)照組和試驗(yàn)組分別經(jīng)大腸桿菌處理30 min和60 min,收集細(xì)胞和上清液。結(jié)果顯示,大腸桿菌誘發(fā)能顯著提高TLR4和NF-κB表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的釋放以及炎性介質(zhì)iNOS(誘導(dǎo)型-氧化氮合酶)的表達(dá)。視黃醇處理能抑制NF-κB表達(dá),進(jìn)而降低炎性細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放和表達(dá),從而達(dá)到保護(hù)乳腺上皮細(xì)胞的作用。

    關(guān)鍵詞:視黃醇;乳腺上皮細(xì)胞;大鼠;NF-κB信號(hào)通路

    乳腺炎在各種乳用家畜甚至是人類普遍存在,奶牛乳腺炎更是頻繁發(fā)生,全世界約有1/3的奶?;加懈鞣N類型的乳腺炎,是制約奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要疾病之一[1]。目前,臨床上分離的乳腺炎致病菌超過137種,大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli,E.coli)是臨床上環(huán)境性乳腺炎的代表病原[2],存在于奶牛生活的環(huán)境中,如附著在體表尤其是乳頭表面、墊料、廄槽、糞便等處,當(dāng)乳頭管開放時(shí)(擠奶后或乳頭受損等)進(jìn)入乳腺繁殖、擴(kuò)增。奶牛感染大腸桿菌后常引起急性乳腺炎,并伴隨局部和全身癥狀。從理論上講加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,搞好泌乳期和產(chǎn)前的環(huán)境衛(wèi)生,做好擠奶前后的消毒,可以降低環(huán)境性乳腺炎的發(fā)病率。但是實(shí)踐證明,環(huán)境控制并沒有明顯降低大腸桿菌乳腺炎的發(fā)病率。有報(bào)道顯示,在管理良好的奶牛場,高體細(xì)胞數(shù)(SCC)的乳汁中經(jīng)常能分離到大腸桿菌[3-4]。近年來大腸桿菌乳腺炎發(fā)病率有升高的趨勢(shì),特別是在一些飼養(yǎng)管理水平較高的發(fā)達(dá)國家,接觸性乳腺炎有所控制,而大腸桿菌乳腺炎在臨床型乳腺炎中的發(fā)病率有所增加。

    病原菌入侵宿主是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的多因子作用過程,從病原與宿主互作的角度深入研究病原侵染后宿主抵御病原感染的機(jī)制是控制疾病的關(guān)鍵所在[5]。先天性免疫系統(tǒng)是機(jī)體識(shí)別和清除入侵病原體的第一道防線,具有作用廣泛、啟動(dòng)迅速的特點(diǎn),在保護(hù)機(jī)體、抵抗感染的過程中具有極其重要的作用。先天性免疫系統(tǒng)依賴模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別病原體的病原相關(guān)分子模式,進(jìn)而招募相應(yīng)的接頭蛋白,激活信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子的分泌和表達(dá),從而殺傷和清除病原微生物。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是目前在感染性疾病發(fā)病機(jī)制中研究最為廣泛的的一組PRRs,在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)。TLR定位于細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)上廣泛識(shí)別多種PAMPs,通過招募接頭蛋白MyD88(myeloid differentiation factor-88)和TRIF(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β),激活NF-κB(nuclear factor-κB)和IRFs(interferon regulatory factors)信號(hào)通路[6-8]。已有研究證明大鼠乳腺上皮細(xì)胞能表達(dá)TLR2、TLR4和TLR9,在乳腺上皮細(xì)胞抵御致病均感染中發(fā)揮重要的作用[9-11]。

    研究表明,飼料中來源豐富的視黃醇具有維持上皮細(xì)胞的完整性、促進(jìn)動(dòng)物生長、維持正常的視覺等功能。近年來,研究還發(fā)現(xiàn),視黃醇能提高多種免疫細(xì)胞的功能,增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究已表明視黃醇對(duì)LPS誘發(fā)的試驗(yàn)性乳腺炎大鼠具有一定的保護(hù)作用[10],且視黃醇處理能下調(diào)TNF-α、IL-1β、iNOS等多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)[12]。本試驗(yàn)將進(jìn)一步深入探討視黃醇抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)的作用機(jī)制,為奶牛乳腺的健康調(diào)控提供一條新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 大鼠乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

    大鼠乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[10]并加以改進(jìn)。選擇妊娠15~18 d的大鼠,無菌采集乳腺組織,膠原酶與透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化分離乳腺上皮細(xì)胞,多次瞬時(shí)離心(1 000 r/min離心1 min;重復(fù)10次)收集細(xì)胞,調(diào)整密度至 5×105個(gè)/mL,接種于培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%以上,更換培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液,同時(shí)加入藥物處理。試驗(yàn)組加入終濃度為1 μmol/L的視黃醇(DMSO溶解),對(duì)照組更換含相等濃度DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)液處理24 h后,大腸桿菌(multiplicity of infection,MOI=10)處理細(xì)胞,分不同時(shí)間點(diǎn)用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,置于液氮后轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱保存。

    1.2 主要試劑

    乳腺炎致病菌大腸桿菌(NJ0501)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院泌乳生化教研室提供。PVDF膜購自Millipore公司;兔抗鼠TLR-4、NF-κB p65多克隆抗體購自Santa Cruz公司;小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自Bioworld公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、兔抗小鼠IgG購自武漢博士德公司;ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Pierce公司。TNF-α、IL-1β檢測試劑盒購自購于解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所。

    1.3 乳腺細(xì)胞核蛋白與總蛋白的提取

    參照試劑盒說明分別提取大鼠乳腺上皮細(xì)胞核蛋白與總蛋白用于EMSA及Western blot分析,蛋白樣品濃度采用BCA法測定,分裝后保存于-70 ℃。

    1.4 測定指標(biāo)及方法

    1.4.1 Western blot檢測乳腺上皮細(xì)胞中TLR4、MyD88含量 30 μg乳腺上皮細(xì)胞總蛋白提取物經(jīng)10% SDS-PAGE電泳,半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印到PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,分別在兔抗TLR-4抗體、兔抗NF-κB p65抗體(1 ∶ 500稀釋)中4 ℃孵育過夜;TBST充分洗滌,在辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1 ∶ 6 000稀釋)中室溫孵育1 h,TBST充分洗滌后加入化學(xué)發(fā)光液,暗室曝光、顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參照,用同樣方法加小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1 ∶ 5 000 稀釋)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(1 ∶ 6 000 稀釋)對(duì)同一PVDF進(jìn)行檢測。凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行光密度測定,以目的蛋白和GAPDH條帶的光密度比值代表其表達(dá)的相對(duì)水平。

    1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β含量測定 具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.4.3 RT-PCR檢測乳腺上皮細(xì)胞中iNOS表達(dá) 用TRIzol試劑盒提取總RNA,用隨機(jī)引物同時(shí)對(duì)所有樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,建立各樣品的cDNA。用所有待測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的混合樣(每份待測樣品等體積混合)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)條件為:95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s,重復(fù)45個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)標(biāo)基因,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行相對(duì)定量。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    用SPSS 17.0方差分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 乳腺上皮細(xì)胞TLR4、MyD88含量的變化

    由圖1可知,大鼠乳腺上皮細(xì)胞表面有TLR-4存在,大腸桿菌處理后30、60 min大鼠乳腺上皮細(xì)胞TLR-4表達(dá)極顯著升高;與對(duì)照組相比,視黃醇處理能顯著降低大腸桿菌處理60 min后大鼠乳腺上皮細(xì)胞TLR-4水平。

    2.2 乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β分泌的變化

    由圖2可知,正常情況下,大鼠乳腺上皮細(xì)胞釋放的 TNF-α、IL-1β較低,大腸桿菌刺激后大鼠乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β釋放量顯著升高(P<0.05),視黃醇處理能顯著降低大腸桿菌處理60 min后大鼠乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β釋放量。

    2.3 乳腺上皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的變化

    由圖3可知,大鼠乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)大腸桿菌刺激后iNOS mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),視黃醇處理能顯著降低大腸桿菌處理30 min和60 min后大鼠乳腺上皮細(xì)胞NOS mRNA表達(dá)。

    3 討論

    乳是乳腺的分泌產(chǎn)物,乳汁對(duì)新生哺乳動(dòng)物的重要性毋庸置疑, 乳腺的健康是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的基本保障。但是

    作為機(jī)體最大的外分泌腺,乳腺在進(jìn)化、發(fā)育和泌乳再構(gòu)建的過程中時(shí)刻面臨著病原微生物的侵襲,乳腺感染頻繁發(fā)生,尤其在奶牛產(chǎn)業(yè),據(jù)報(bào)道全世界約有2/3的奶牛罹患各種類型的乳腺炎。病原菌入侵乳腺組織是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的多因子作用過程,然而目前宿主對(duì)抗乳腺感染的作用機(jī)制研究尚不深入,這是乳腺炎得不到有效控制的原因之一。

    TLRs是一組保守的介導(dǎo)機(jī)體天然免疫反應(yīng)的跨膜受體蛋白,廣泛分布于髓源細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞等20多種細(xì)胞中[13-14]。TLRs通過識(shí)別病原微生物、偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑,激活天然免疫細(xì)胞,最終啟動(dòng)一系列的免疫炎癥反應(yīng),是天然免疫系統(tǒng)中最為重要的模式識(shí)別受體[15-17]。TLR-4是革蘭氏陰性菌及其內(nèi)毒素發(fā)揮生物學(xué)效用的特異性受體[18],TLR-4的表達(dá)可以作為革蘭氏陰性菌引起的乳腺炎的生物標(biāo)記分子。本研究證實(shí)原代培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞表面有TLR-4的存在,并且正常情況下該受體表達(dá)量較低,而大腸桿菌侵染能顯著刺激TLR-4的表達(dá),視黃醇對(duì)TLR-4的表達(dá)影響不顯著。

    病原微生物刺激后,位于細(xì)胞膜表面的TLR通過胞外區(qū)富含亮氨酸的重復(fù)序列將刺激信號(hào)傳入胞內(nèi),活化胞核內(nèi)的NF-κB[19],并促進(jìn)相關(guān)炎性細(xì)胞因子釋放到胞外。在本試驗(yàn)中,大腸桿菌處理大鼠乳腺上皮細(xì)胞后,NF-κBp65表達(dá)活性顯著升高,視黃醇預(yù)處理能極顯著降低NF-κB p65表達(dá),與先前研究結(jié)果一致,表明視黃醇能顯著提高核內(nèi)視黃醇受體-α(retinoid receptor-α,RAR-α)的表達(dá),而RAR-α可以與NF-κB上的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合,從而降低NF-κB的生物學(xué)活性[20]。

    大腸桿菌或其致病因子通過TLR-4/NF-κB信號(hào)途徑合成并釋放細(xì)胞因子,任何NF-κB的抑制劑均能抑制其誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。TNF-α、IL-1β是LPS(脂多糖)通過TLR-4跨膜激活核轉(zhuǎn)錄因子后產(chǎn)生的重要炎性因子,LPS處理后引起各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)極顯著升高,視黃醇處理能顯著抑制上述基因的過度表達(dá)。iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)是NO合成的限速酶,NO是體內(nèi)重要的信號(hào)分子,具有多種生物學(xué)功能,一方面NO具有直接的殺菌作用,另一方面NO能加快血液循環(huán),促使更多的PMN(中性粒細(xì)胞)向組織遷徙發(fā)揮吞噬活性[21-22]。但iNOS持續(xù)活化產(chǎn)生過量NO是引起組織損傷的一個(gè)重要因素。在本研究中,LPS極顯著刺激各個(gè)時(shí)間點(diǎn)iNOS mRNA的過度表達(dá),視黃醇顯著下調(diào)炎癥反應(yīng)后期該基因的表達(dá)。與先前報(bào)道一致,視黃醇能通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB p65和p50亞基的活性從而降低iNOS的并表達(dá)[23-24]。

    4 小結(jié)

    研究表明大腸桿菌通過TLR-4/NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)原代大鼠乳腺上皮細(xì)胞炎性相關(guān)因子的表達(dá),視黃醇能抑制NF-κB活性,抑制相關(guān)炎性因子的過度表達(dá),這可能是視黃醇保護(hù)乳腺對(duì)抗感染的原因之一。

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