高效液相色譜法測(cè)定化妝品中類視黃醇含量

羊潔芳，樓美娟，盧 力，姜士磊

（義烏市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 義烏 322000）

隨著年齡的增長(zhǎng)，人的皮膚會(huì)長(zhǎng)出歲月的溝壑，最直接的原因是皮膚組織結(jié)構(gòu)中角質(zhì)層細(xì)胞的減少.類視黃醇物質(zhì)可有效改善這一趨勢(shì).視黃醇被人體表皮細(xì)胞吸收后由視黃醇脫氫酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)橐朁S醛，視黃醛進(jìn)一步被快速氧化成視黃酸，最終視黃酸與相關(guān)受體結(jié)合，促進(jìn)角質(zhì)層細(xì)胞形成和代謝[1-2].雖然視黃酸可直接發(fā)揮作用，但其作為藥用成分不得添加于化妝品中[3]，故類視黃醇成為化妝品公司追捧的對(duì)象[4-5].大量研究表明，類視黃醇在淡化細(xì)紋、細(xì)致毛孔方面作用顯著，更有早晨涂抹維生素C，晚上涂抹維生素A（即視黃醇），可以科學(xué)抗老的說(shuō)法，深受年輕人喜愛[6].類視黃醇是多烯烴類物質(zhì)，易受日光、溫度、酸堿、重金屬等影響，分解生成副產(chǎn)物，過(guò)量添加、保存不當(dāng)?shù)葧?huì)造成皮膚干燥脫皮、紅腫過(guò)敏、發(fā)炎等不良反應(yīng)[7-8].通過(guò)Carlotti 等[7]的研究，發(fā)現(xiàn)在類視黃醇中加入少量抗氧化劑二丁基羥基甲苯，可起到穩(wěn)定作用.因此，建立科學(xué)的測(cè)定方法檢測(cè)化妝品中類視黃醇的含量尤為重要.

目前《已使用化妝品原料目錄》2021 版中已包含視黃醇、視黃醛、視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯、視黃醇視黃酸酯、視黃醇棕櫚酸酯6 種類視黃醇物質(zhì)，但《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015 版中并無(wú)這6 種物質(zhì)的檢測(cè)方法和限量要求.當(dāng)下對(duì)類視黃醇的分析主要采用液相色譜分析法[9-13].劉玉玲等[9]對(duì)化妝品中阿達(dá)帕林、維甲酸、異維甲酸、維胺酯、他扎羅汀、視黃醇、視黃醇醋酸酯、視黃醇丙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯9 種成分進(jìn)行液相色譜分析，該試驗(yàn)以甲醇∶異丙醇（體積比55∶45）為溶劑對(duì)視黃醇丙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯、他扎羅汀、維胺酯等的提取能力較低，檢出能力較差，且未對(duì)可能含有這9 種成分的化妝品樣品進(jìn)行測(cè)定，方法的可靠性有待考證.與之相比，本文對(duì)化妝品中6 種類視黃醇測(cè)定的不同與創(chuàng)新之處在于，比較了6 種類視黃醇在不同有機(jī)溶劑中的溶解性，研究了不同提取溶劑對(duì)6種類視黃醇的提取能力，對(duì)類視黃醇的檢測(cè)具有更低的檢出限和更高的提取效果.閆秀芳等[10]對(duì)化妝品中視黃醇、視黃醛、視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯、羥基頻吶酮視黃酸酯、視黃醇視黃酸酯7 種視黃醇衍生物進(jìn)行液相色譜法研究，其中視黃醇與視黃醛、視黃醇乙酸酯與羥基頻吶酮磺酸酯的分離度略差，試驗(yàn)難以重現(xiàn)，且出峰時(shí)間較晚，檢出能力較差.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法集中于對(duì)視黃醇及其衍生物的順反異構(gòu)體分析研究[14]，以及視黃醇和其他維生素在生物細(xì)胞中的代謝研究[15].可知液相色譜儀已能滿足檢測(cè)要求.本研究擬通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件，建立高效、準(zhǔn)確、靈敏的液相色譜法測(cè)定化妝品中類視黃醇的含量.

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器：Agilent 1260 Infinity II 高效液相色譜配二 極 管 陣 列 檢 測(cè) 器（DAD）（Agilent）；色 譜 柱1（Extend-C18 柱，4.6 mm×250 mm, 5 μm，型 號(hào)：990967-906，Agilent）；色譜柱2（ZORBAX ODS，4.6 mm×250 mm, 5 μm，型號(hào)：880952-702，Agilent）；分析天平（ME204E，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；純水儀（OQ007XXM1，ELGA）；超聲波清洗器（KQ-600E，昆山市超聲儀器有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（3-30k，Sigma）.

試劑：四氫呋喃，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酸，液相色譜專用，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品：視黃醇純度95%，視黃醇視黃酸酯純度98%，上海麥克林生化科技有限公司；視黃醛純度98%，視黃醇丙酸酯純度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；視黃醇乙酸酯純度95.23%，德國(guó)DR EHRENSTORFER 公司；視黃醇棕櫚酸酯純度96%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；二丁基羥基甲苯純度98.8%，德國(guó)DR EHRENSTORFER 公司.化妝品樣品購(gòu)自淘寶.

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm,5 μm），柱溫：30 ℃，流動(dòng)相A：0.5%乙酸水溶液，流動(dòng)相B：四氫呋喃，采用梯度洗脫程序，具體條件如表1 所列.流速：1.0 mL/min，DAD 檢測(cè)波長(zhǎng)：328、350、382 nm，進(jìn)樣量：10 μL.

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

分別稱取視黃醇、視黃醛、視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯、視黃醇視黃酸酯、視黃醇棕櫚酸酯6種標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg 于25 mL 棕色容量瓶中，用四氫呋喃溶解并定容至刻度，搖勻后，得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于?18 ℃冰箱錫紙包裹避光保存.

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于25 mL 棕色容量瓶中，加入0.05 mL 二丁基羥基甲苯[7]（簡(jiǎn)稱BHT，200 mg/L），用四氫呋喃定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0 ℃冰箱錫紙包裹避光保存.

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水∶四氫呋喃（體積比2∶8）稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.3.2 樣品預(yù)處理

稱取1.0 g（精確至0.001 g）樣品，置于10 mL棕色具塞比色管中，加入8 mL 水∶四氫呋喃（體積比2∶8）溶液，渦旋震蕩1 min，超聲提取20 min，冷卻至室溫并定容.轉(zhuǎn)移至15 mL 棕色離心管中，以6 000 r/min 離心5 min，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)系濾膜過(guò)濾，濾液為待測(cè)液.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

對(duì)視黃醇、視黃醛、視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯、視黃醇視黃酸酯、視黃醇棕櫚酸酯6 種類視黃醇進(jìn)行DAD 檢測(cè)分析.掃描發(fā)現(xiàn)視黃醇、視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯的最大吸收波長(zhǎng)為328 nm，視黃醛的最大吸收波長(zhǎng)為382 nm，視黃醇視黃酸酯的最大吸收波長(zhǎng)為350 nm.故確定以328、382、350 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，按1.2 項(xiàng)儀器工作條件對(duì)質(zhì)量濃度為5 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測(cè)，其色譜圖如圖1 所示.

2.2 色譜柱的優(yōu)化

通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，維A 酸及其衍生物的痕量分析多采用C18 柱進(jìn)行分離[3,9,10,12,16].因此本試驗(yàn)對(duì)比了Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）和Agilent ZORBAX ODS（4.6 mm×250 mm, 5 μm）兩種C18 柱的分離效果.對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩種色譜柱出峰時(shí)間一致，但在Agilent Extend-C18 色譜柱上6 種物質(zhì)分離情況更理想，峰形更好，響應(yīng)更高，故選擇該色譜柱進(jìn)行分析.

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

通過(guò)考察文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)[16]，可知視黃酸類衍生物多采用甲醇與0.5%乙酸水溶液作為流動(dòng)相.借鑒后嘗試以甲醇∶0.5%乙酸水溶液（體積比9∶1）為流動(dòng)相運(yùn)行30 min，只得到重疊的前4 種物質(zhì)（即視黃醇、視黃醛、視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯），后2 種物質(zhì)（視黃醇視黃酸酯、視黃醇棕櫚酸酯）并未檢出.當(dāng)改用四氫呋喃∶0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，隨著比例的調(diào)整，6 種物質(zhì)得到有效分離.在水相中加入0.5%乙酸，可改善峰形，使得峰對(duì)稱性更好.另外0.5%乙酸濃度低，在梯度洗脫過(guò)程中并不會(huì)分解類視黃醇衍生物，在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加二丁基羥基甲苯，起到維持目標(biāo)物穩(wěn)定的作用.最終確定以四氫呋喃∶0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫.

2.4 溶解性試驗(yàn)

由于視黃醇、視黃醛、視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯、視黃醇視黃酸酯、視黃醇棕櫚酸酯6 種物質(zhì)都是弱極性化合物，水∶四氫呋喃混合溶液極性偏大，為確保分離的可靠性，需驗(yàn)證這6 種物質(zhì)在混合溶液中的溶解性.設(shè)計(jì)采用不同比例的水與四氫呋喃、甲醇、乙腈、異丙醇混合溶液對(duì)同濃度下6 種類視黃醇混合溶液進(jìn)行溶解，觀察溶液是否有析出.按1.3.1 項(xiàng)制備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的方法制備添加二丁基羥基甲苯的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L 進(jìn)行溶解性試驗(yàn).如表2 所列，水與四氫呋喃的混合溶液對(duì)這6 種物質(zhì)的溶解力最強(qiáng)，水與異丙醇的混合溶液次之，甲醇與水、乙腈與水的混合溶液最弱.特別是當(dāng)水與四氫呋喃混合溶液比例為2∶8 和3∶7 時(shí)對(duì)這6 種物質(zhì)具有良好的溶解性.

表2 不同水-有機(jī)溶劑比例的混合溶液對(duì)同濃度下6 種類視黃醇的溶解試驗(yàn)Table 2 Dissolution experiments of 6 retinoids at same concentration by mixed solutions with different waterorganic solvents ratios

2.5 提取溶劑的優(yōu)化

選擇空白化妝品膏霜為檢測(cè)樣品，加入相同質(zhì)量濃度為5 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，考察6種物質(zhì)的峰面積.分別以甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃、水∶甲醇、水∶乙腈、水∶異丙醇、水∶四氫呋喃混合溶液提取目標(biāo)物，每種溶劑平行測(cè)定兩次，取平均值，結(jié)果如表3 所列.由表3 可知，四氫呋喃作為提取溶劑效率優(yōu)于甲醇、乙腈、異丙醇，其中以水∶四氫呋喃（體積比2∶8）混合溶液作為提取溶劑對(duì)6 種目標(biāo)物的提取結(jié)果較為理想，故選擇水∶四氫呋喃（體積比2∶8）作為提取溶劑.

表3 不同提取溶劑下6 種目標(biāo)物的峰面積(n=2)Table 3 Peak areas of 6 retinoids with different extraction solvents (n=2)

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、空白樣品、空白樣品加6種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的疊加色譜圖如圖2 所示，樣品為不含類視黃醇的面霜.圖中編號(hào)1、4、7，編號(hào)2、5、8，編號(hào)3、6、9 譜圖依次為質(zhì)量濃度為5 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，空白樣品，空白樣品加5 mg/L 6種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖.其中，空白樣品與空白樣品加標(biāo)按1.3.2 樣品預(yù)處理、1.2 儀器工作條件進(jìn)行分析.

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、空白樣品、空白樣品加標(biāo)色譜圖（1）混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：1、4、7，（2）空白樣品：2、5、8，（3）空白樣品加標(biāo)：3、6、9Fig.2 Chromatograms of mixed standard working solutions, blank samples and labeled blank samples(1) lines 1, 4, 7 of mixed standard working solutions, (2) lines 2, 5, 8 of blank samples, (3) lines 3, 6, 9 of labeled blank samples

2.6 線性方程和檢出限

在上述色譜條件下，對(duì)6 種類視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行高效液相色譜分析.以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均不小于0.999 93.采用外標(biāo)法通過(guò)線性回歸方程對(duì)6 種類視黃醇化合物進(jìn)行定量分析.選取空白化妝品膏霜為基質(zhì)樣品，稱取約1.0 g（精確至0.001 g）樣品，通過(guò)制備加標(biāo)樣品的方式，測(cè)定0.5、0.7、1.5、2.1 mg/kg 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下類視黃醇的信噪比(S/N)，每個(gè)濃度做3 個(gè)平行加標(biāo)樣，根據(jù)所得S/N＞3、S/N＞10 分別檢測(cè)各物質(zhì)的檢出限和定量限，結(jié)果如表4 所列.

表4 6 種類視黃醇的線性回歸、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及方法檢出限（n=3）Table 4 Linear regression equations, correlation coefficient, linear ranges and method detection limits of 6 retinoids (n=3)

2.7 回收率和精密度

選擇未檢出類視黃醇的3 種化妝品基質(zhì)樣品：水劑型、乳液型、膏霜型，各稱取樣品1.0 g，分別加入類視黃醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）0.05、0.5、1.0 mL，使加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.5、5.0、10.0 mg/L 3 個(gè)水平，每種水平做6 個(gè)平行樣品，按上述樣品前處理和色譜條件進(jìn)行分析，所得回收率與精密度較好，結(jié)果如表5 所列.6 種類視黃醇的回收率在91.3%～107.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.9%～4.7%之間，說(shuō)明該方法具有穩(wěn)定的回收率和良好的精密度.

表5 6 種類視黃醇的加標(biāo)回收率和RSDs（n=6）Table 5 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 6 retinoids (n=6)

2.8 樣品測(cè)定

用建立的方法對(duì)市面上商家聲稱含有類視黃醇的12 種化妝品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如表6 所列，陽(yáng)性樣品精華液2 色譜圖如圖3 所示.其中，晚霜3 未檢出視黃醇和視黃醇棕櫚酸酯，精華乳2 標(biāo)簽中只標(biāo)明含有視黃醇，卻檢出少量視黃醛，精華液3 只檢出視黃醇，未檢出視黃醇棕櫚酸酯，以上3 款皆與標(biāo)簽不符.此外，精華液3 在使用時(shí)需要先按壓泵頭，使保鮮倉(cāng)內(nèi)含有視黃醇及其衍生物的精華液釋放至肌底精華液中，再通過(guò)搖晃瓶身混勻，最后擠壓出混合精華液進(jìn)行涂抹.實(shí)際操作過(guò)程中，按壓泵頭的手法會(huì)影響泵出的精華液量，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果平行性較差，影響使用效果，建議商家改進(jìn)包裝，方便精準(zhǔn)使用.精華液2 商家聲明視黃醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%（其余商家未標(biāo)注含量），本方法測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，說(shuō)明本方法可準(zhǔn)確測(cè)定化妝品中6種類視黃醇含量.精華液4 商家聲明采用超分子包裹技術(shù)，起到緩釋視黃醇的作用，實(shí)際測(cè)定視黃醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.020%.降低視黃醇濃度、減少刺激的同時(shí)，延長(zhǎng)作用時(shí)間，可保護(hù)消費(fèi)者安全使用類視黃醇，提高該化妝品作用效果.

圖3 陽(yáng)性樣品精華液2 譜圖Fig.3 Chromatograms of positive sample about essence 2

表6 化妝品中類視黃醇含量測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of 6 retinoids in cosmetics/%

3 結(jié)論

本研究建立了測(cè)定化妝品中視黃醇、視黃醛、視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯、視黃醇視黃酸酯、視黃醇棕櫚酸酯6 種類視黃醇的高效液相色譜分析方法.經(jīng)驗(yàn)證，該方法線性相關(guān)性良好，檢出限低，可應(yīng)用于水劑型、乳液型、膏霜型化妝品中，準(zhǔn)確分析市售化妝品中這6 種類視黃醇的含量.該方法具有前處理簡(jiǎn)單、檢出限低、回收率高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，為更好的研究化妝品中6 種類視黃醇含量提供技術(shù)支持.