高等植物K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制研究進(jìn)展

段慧榮，周學(xué)輝，胡靜，段瀟蓉，田福平，崔光欣，王春梅，楊紅善*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所, 甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省治沙研究所, 甘肅省荒漠化與風(fēng)沙災(zāi)害防治重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地, 甘肅 蘭州 730070；3.國網(wǎng)山西省電力公司電力科學(xué)研究院, 山西 太原 030000)

K+是植物中含量最多的陽離子，也是植物生長必需的營養(yǎng)元素。作為重要的無機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑和酶促劑，K+參與植物細(xì)胞內(nèi)諸多生理及代謝過程。土壤鹽堿化是限制作物生長、影響生態(tài)環(huán)境的一個主要非生物因素。植物體內(nèi)積累過多的Na+會限制K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，擾亂植物對K+和其他礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，引起生長受抑甚至死亡。近年來，有關(guān)植物體內(nèi)K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。

K+被植物根系吸收后有效向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)過程需通過質(zhì)膜和液泡膜，主要由次級K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和K+通道介導(dǎo)。參與植物體內(nèi)K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白或通道共有5類：KT/HAK/KUP家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(KT/HAK/KUP K+transporters)、HKT家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HKT transporters)、CPAs(cation-proton antiporters)家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Shaker通道(Shaker-like K+channels)和TPK通道(tandem-pore K+channels)[1]。早期，Epstein等[2]發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)存在兩條不同的K+吸收機(jī)制：機(jī)制Ⅰ主要由K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)外界低濃度(μmol)下K+(Rb+)的吸收，機(jī)制Ⅱ主要由K+通道介導(dǎo)外界較高濃度(mmol)下K+(Rb+)的吸收。Coskun等[3]對擬南芥(Arabidopsisthaliana)和大麥(Hordeumvulgare)根中K+轉(zhuǎn)運(yùn)的兩種機(jī)制重新進(jìn)行評估后發(fā)現(xiàn)，外界高濃度K+條件下，阻斷質(zhì)外體途徑的K+內(nèi)流后，低親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)和高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)過程可同時存在，這表明植物K+內(nèi)流的適度上限受質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白控制。本研究對3類主要的K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通道進(jìn)行歸納總結(jié)，從結(jié)構(gòu)特征、定位和組織表達(dá)、功能調(diào)控等方面進(jìn)行綜合概述，以期為今后深入研究植物K+的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)奠定基礎(chǔ)。

1 KT/HAK/KUP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

1.1 結(jié)構(gòu)特征

KT/HAK/KUP屬于APC(amino acid-polyamine-organocation)超級家族，廣泛存在于原核生物、真菌和高等植物中，在低等植物如小立碗蘚(Physcomitrellapatens)和蕨(Selaginellamoellendorffii)中也普遍存在[4]。該家族中的基因被不同研究者以不同的縮寫命名，包括KT，HAK和KUP。植物中最早克隆到的KT/HAK/KUP成員是大麥HvHAK1[5]和擬南芥AtKUP1/KT1，AtKUP2/KT2[6]。之后，從玉米、甜椒(Capsicumannuum)、冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、葡萄和番茄等植物中陸續(xù)克隆到該家族成員基因[7]。擬南芥、水稻、玉米和楊樹中分別含有13、27、27和31個該家族成員(表1)[7]。

目前，KT/HAK/KUP家族晶體結(jié)構(gòu)的研究尚不清楚，該家族雖不具有完全相同的功能保守域，但氨基酸序列中均含有GVVYGDLGTSPLY(加粗字母表示在所有基因中均保守)，疏水結(jié)構(gòu)分析預(yù)測表明，該家族蛋白成員含有10～14個跨膜區(qū)域(TM10-TM14)(表1)[8]。Nieves-Cordones等[9]從46個被子植物的全基因組測序結(jié)果中選出了913個KT/HAK/KUP家族成員，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，可將該家族劃分為5個亞族。亞族Ⅰ成員以擬南芥AtHAK5、水稻OsHAK5和葡萄VvKUP1等為代表；亞族Ⅱ成員以擬南芥AtKUP1、AtKUP2、AtKUP3、AtKUP6、AtKUP8等為代表；亞族Ⅲ成員以AtKUP9、AtKUP10和AtKUP11等為代表；亞族Ⅳ成員以水稻OsHAK4和OsHAK17為代表；亞族Ⅴ成員以AtKUP5、AtKUP7和AtKUP12等為代表。亞族Ⅱ和亞族Ⅲ成員在雙子葉和單子葉植物中的分布都很保守，亞族Ⅰ和Ⅳ的成員則可能在植物適應(yīng)環(huán)境中發(fā)揮特殊的作用，這在雙子葉植物擬南芥、葡萄、蒺藜苜蓿和單子葉植物水稻、玉米、短柄草中都可以得到驗證[4]。

1.2 定位和組織表達(dá)

KT/HAK/KUP家族成員定位在植物不同細(xì)胞器的膜上，如質(zhì)膜、液泡膜、類囊體膜等[7,10]。水稻OsHAK21定位在質(zhì)膜上，在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞和內(nèi)皮層細(xì)胞中表達(dá)[11]。用融合綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)方法將水稻OsHAK10瞬時表達(dá)在洋蔥(Alliumcepa)表皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)它定位在液泡膜上[12]。擬南芥葉綠體蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)了AtKUP12的存在，其定位在葉綠體膜上[13]。同一亞族的家族成員具有并不相同的細(xì)胞定位，可能發(fā)揮著不同的細(xì)胞生物學(xué)功能。如亞族Ⅱ成員擬南芥AtKUP4定位于液泡膜，水稻OsHAK2和OsHAK3定位于細(xì)胞質(zhì)膜，陸地棉GhKT2定位在質(zhì)膜上[14]，而OsHAK10則定位于液泡膜。

KT/HAK/KUP家族成員在大多數(shù)植物組織中均有表達(dá)，在不同的組織中發(fā)揮各自不同的調(diào)節(jié)作用(表2)。正常生長條件下，亞族Ⅰ成員如大麥HvHAK1、水稻OsHAK1和OsHAK5、擬南芥AtHAK5、甜椒CaHAK1、 番茄LeHAK5、 梨(Pyrusbretschneideri)PbrHAK12/16和鹽芥(Thellungiellahalophila)ThHAK5在植物根和地上部中的表達(dá)量較低，當(dāng)遭受K+饑餓后，表達(dá)水平顯著上調(diào)[15-16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些成員的表達(dá)也受到其他離子如Na+和NH4+的調(diào)節(jié)[17]。例如，在100 mmol·L-1NaCl處理下，耐鹽蘆葦(Phragmitesaustralis)品種中PhaHAK2的轉(zhuǎn)錄水平要遠(yuǎn)高于鹽敏感蘆葦品種的水平[18]。冰葉日中花中McHAK1和McHAK3的表達(dá)也受NaCl脅迫的誘導(dǎo)[19]。K+饑餓條件下，NH4+能顯著誘導(dǎo)大麥HvHAK1和番茄LeHAK5的表達(dá)，卻抑制擬南芥AtHAK5和甜椒CaHAK1的表達(dá)[20-21]。其他因素如激素也能參與調(diào)控該家族成員基因的表達(dá)調(diào)控。研究表明，擬南芥中，AtKUP6受ABA(abscisic acid)誘導(dǎo)[22]；AtKUP4和AtHAK/KT12的表達(dá)受IAA(indole-3-acetic acid)的顯著誘導(dǎo)，但受IAM(indole-3-acetamide)的抑制；AtHAK5受乙烯的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[23]，但受細(xì)胞分裂素的明顯抑制[24]。此外，HAK5在番茄和擬南芥中的轉(zhuǎn)錄還受NO3-或磷酸鹽(Pi)供應(yīng)的調(diào)控[25]。在植物生長過程中，KT/HAK/KUP家族成員亦能被誘導(dǎo)，如葡萄漿果表皮生長的過程可以誘導(dǎo)VvKUP1和VvKUP2的表達(dá)[26]，棉花(Gossypiumhirsutum)纖維細(xì)胞的伸長過程會誘導(dǎo)GhKT1的表達(dá)[27]，后期的生節(jié)過程中百脈根(Lotusjaponicus)LjKUP表現(xiàn)出了很高的轉(zhuǎn)錄水平[28]。

表1 KT/HAK/KUP、HKT和Shaker家族的比較Table 1 Comparison of KT/HAK/KUP, HKT and Shaker family

表2 不同高等植物中的KT/HAK/KUP家族成員Table 2 Members of KT/HAK/KUP family in different plants

1.3 功能及調(diào)控

KT/HAK/KUP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopusoocytes)中不表達(dá)，因此，該家族成員的轉(zhuǎn)運(yùn)特性常用酵母(Saccharomycescerevisiae)或大腸桿菌(Escherichiacoli)等異源表達(dá)系統(tǒng)來驗證[29]。KT/HAK/KUP家族成員能夠恢復(fù)酵母或細(xì)菌K+吸收缺陷突變體的K+吸收能力，在植物如擬南芥中也已經(jīng)證明其在維持根和地上部的K+穩(wěn)態(tài)平衡過程中起重要作用[21,30]。該家族成員除能夠轉(zhuǎn)運(yùn)K+外，還能轉(zhuǎn)運(yùn)Rb+、Cs+等，受NH4+調(diào)控[5,20]，轉(zhuǎn)運(yùn)H+的能力尚需進(jìn)一步驗證。

亞族Ⅰ成員在該家族中研究最廣泛最深入，已經(jīng)被證明能參與雙子葉和單子葉植物的高親和性K+吸收，其主要代表為擬南芥AtHAK5、大麥HvHAK1和水稻OsHAK1，它們能夠促進(jìn)植物根系從外界低濃度K+環(huán)境中吸收K+，從而適應(yīng)低K+條件下的生長[13,31-33]。亞族Ⅱ成員根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)特性和生理作用的不同具有功能多樣性，主要代表成員為擬南芥AtKT1/AtKUP1，AtKT2/AtKUP2，AtKT3/AtKUP4/TRH1和大麥HvHAK2。對單子葉植物而言，亞族Ⅱ的很多成員經(jīng)常參與低親和性K+吸收過程，雙子葉植物中此類成員表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，如擬南芥AtKUP6介導(dǎo)低親和性K+吸收[34]，AtKUP4/TRH1介導(dǎo)高親和性K+吸收[35]。AtKUP1介導(dǎo)兼性K+吸收，在K+濃度100～200 μmol·L-1時從高親和性轉(zhuǎn)為低親和性K+吸收[36]。此外，Na+對該家族成員也有不同的影響。部分成員如HvHAK1，PhaHAK2和PhaHAK5可在mmol·L-1濃度范圍內(nèi)參與Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)[5,18]?？果}蘆葦品種的PhaHAK2-n和PhaHAK2-e均受K+饑餓和高鹽脅迫的誘導(dǎo)，可能在鹽脅迫下持續(xù)發(fā)揮K+吸收功能，從而維持體內(nèi)高K+/Na+比，提高蘆葦耐鹽性[37]。對AtHAK5或OsHAK1而言，Na+對其介導(dǎo)的K+吸收有明顯的競爭抑制作用[31]。此外，雖然OsHAK5與AtHAK5或OsHAK1的同源性很近，但OsHAK5能夠介導(dǎo)對Na+不敏感的K+吸收[38]。有關(guān)亞族Ⅲ和Ⅳ成員的研究報道較少。亞族Ⅲ的成員AtHAK11可以介導(dǎo)K+和Rb+的吸收。鹽敏感蘆葦品種的PhaHAK5-u屬于亞族Ⅳ成員，在酵母中被證實是高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)體，在Na+存在時也參與介導(dǎo)低親和性Na+轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。亞族Ⅴ的成員AtKUP7和AtKUP12略有研究，其中AtKUP7參與K+虧缺條件下K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，AtKUP12可能參與擬南芥的光合作用過程[39]。

在擬南芥中，通過測定野生型和突變體(akt1或athak5)根中Rb+(或K+)動力學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)AtHAK5是外界K+濃度低于10 μmol·L-1下介導(dǎo)K+吸收的唯一系統(tǒng)[40]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，由于AtHAK5對Cs+的可滲透性，在外界低K+條件下，AtHAK5能介導(dǎo)Cs+進(jìn)入植物根中引起毒性反應(yīng)[41]。亞族Ⅱ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠影響植物發(fā)展過程，尤其是細(xì)胞伸長過程：擬南芥AtKUP4/TRH1在根部和冠部都有大量表達(dá)，其T-DNA插入突變體trh1的根毛伸長明顯減緩，參與植物激素的根特異分布，影響根尖激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的極性定位，能建立向地生長和根毛形成的激素梯度[35]。缺失AtKUP2/SHY3的突變體shy3會引起黑暗處理下地上部生長的缺陷，表明AtKUP2能夠影響細(xì)胞的生長，但具體機(jī)制尚不清楚[30]。擬南芥atkup2/6/8突變體的生長受到促進(jìn)，植株的K+吸收特征結(jié)果表明，AtKUP2、AtKUP6和AtKUP8可能介導(dǎo)K+外流，此外，該突變體的保衛(wèi)細(xì)胞和側(cè)根細(xì)胞中對ABA敏感性的響應(yīng)降低，表明KT/HAK/KUP家族成員在植物側(cè)根細(xì)胞對激素的敏感性響應(yīng)過程中有重要作用[22]。普遍認(rèn)為，磷酸化是激活植物KT/HAK/KUP家族轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的主要方式。Osakabe等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，AtKUP6能被OST1磷酸化激活，這表明AtKUP6是參與ABA介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉的調(diào)控因子。AtHAK5及其在其他物種中的同源物可被CIPK23/CBL1復(fù)合物激活，捕蠅草(Dionaeamuscipula)中也發(fā)現(xiàn)了DmHAK5類似的受CIPK23/CBL9復(fù)合物激活的現(xiàn)象[42]。

2 HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

2.1 結(jié)構(gòu)特征和分類

HKT高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是廣泛存在于真核生物和原核生物中的一類超級蛋白家族，其中，植物HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與真菌和原核生物中Trk/Ktr陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的同源性很高[50]。Schachtman等[51]從小麥中得到的TaHKT2;1，是高等植物中的第一個高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，后被證實是K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。隨后，研究者相繼從不同植物如擬南芥、赤桉(Eucalyptuscamaldulensis)、水稻和冰葉日中花等中克隆并鑒定了其同源基因。根據(jù)異源表達(dá)系統(tǒng)中對Na+、K+轉(zhuǎn)運(yùn)特性的不同，HKT可被分為兩類：第Ⅰ類以AtHKT1;1為代表，主要轉(zhuǎn)運(yùn)Na+，如HvHKT1;1/2，OsHKT1;2和TaHKT1;1/2等；第Ⅱ類以TaHKT2;1為代表，功能是K+∶Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)，包括EcHKT1;1/2，HvHKT2;1，OsHKT2;1，OsHKT2;2等，雙子葉植物中缺少第Ⅱ類基因成員[52]。

Durell等[53]認(rèn)為植物HKT蛋白含有4個MPM高度保守結(jié)構(gòu)和1個甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸(GYG)基序，是由僅有一個MPM結(jié)構(gòu)的原核生物KcsA類K+通道經(jīng)復(fù)制加倍及融合進(jìn)化而來的。按照此模型，植物HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)體由8個跨膜結(jié)構(gòu)域、4個P環(huán)、短的N-末端和C-末端組成，其中4個MPM結(jié)構(gòu)(1個MPM結(jié)構(gòu)包括2個跨膜螺旋和1個P環(huán))形成四倍徑向?qū)ΨQ結(jié)構(gòu)，4個P環(huán)與中央的疏水結(jié)構(gòu)形成蛋白的滲透途徑，為該蛋白最狹窄的區(qū)域，作為選擇性過濾器(表1)。HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)模型最初是通過序列分析得到的，后在生化層面得到證實，最近的原核生物Trk/Ktr類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)研究為此提供了進(jìn)一步的證據(jù)[54]。此外，HKT蛋白在P環(huán)或其附近有多個K+∶Na+選擇性吸收位點。HKT的第一個P環(huán)過濾器位置處有1個氨基酸殘基對其離子轉(zhuǎn)運(yùn)特性起著調(diào)控作用：第Ⅰ類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常第1個P環(huán)中過濾器處為絲氨酸殘基(S)，第Ⅱ類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在相應(yīng)位置處常為甘氨酸殘基(G)[55]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)K+∶Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)的第Ⅱ類HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的甘氨酸并非是決定其K+選擇性吸收特性的唯一氨基酸殘基，因為一些Na+特異性轉(zhuǎn)運(yùn)的第Ⅰ類HKT蛋白也具有K+轉(zhuǎn)運(yùn)特性，且賴氨酸和精氨酸也參與調(diào)控其K+轉(zhuǎn)運(yùn)活性[55]。此外，亞族Ⅰ大部分成員在第2個P環(huán)區(qū)域的保守位置氨基酸是谷氨酰胺Asn(N)，當(dāng)N突變?yōu)锳sp(D)后，成員的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)特性轉(zhuǎn)變?yōu)镹a+∶K+共轉(zhuǎn)運(yùn)特性，這在擬南芥AtHKT1;1、鹽芥TsHKT1;2及EutremaparvulaEpHKT1;1中均得到驗證[56-58]。

2.2 定位和組織表達(dá)

HKT家族成員定位在根表皮細(xì)胞膜及根、莖、葉鞘木質(zhì)部薄壁細(xì)胞膜等處。研究表明，亞族Ⅰ成員野大麥HvHKT1;1、玉米ZmHKT1、水稻OsHKT1;4定位在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞膜上，擬南芥AtHKT1;1、番茄SlHKT1;1和SlHKT1;2、契斯曼尼番茄(Solanumcheesmaniae)ScHKT1;1和ScHKT1;2定位于木質(zhì)部薄壁細(xì)胞的質(zhì)膜和韌皮部上[59-62]。Rosas-Santiago等[63]卻發(fā)現(xiàn)，水稻OsHKT1;3定位在高爾基體上。亞族Ⅱ成員冰葉日中花McHKT2、水稻OsHKT2;1和OsHKT2;2/1均定位在質(zhì)膜上[64-65]。

HKT家族成員在不同植物中的表達(dá)部位和調(diào)控效應(yīng)不同(表3)。番茄和契斯曼尼番茄中的Sl(Sc)HKT1;1和Sl(Sc)HKT1;2在根、莖和葉中均有表達(dá)，當(dāng)遭受鹽脅迫時，根中Sl(Sc)HKT1;1和Sl(Sc)HKT1;2的表達(dá)顯著上調(diào)，而葉和莖中Sl(Sc)HKT1;2的表達(dá)卻下降[62]。小麥TaHKT2;1和TaHKT2;2在葉片、葉鞘和根中均有表達(dá)[66]。水稻、大麥、蘆葦、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)等植物中，HKT2;1在葉中有高表達(dá)，根中表達(dá)量較低[51,56-57,67-69]。水稻中的HKT家族成員最多，目前在粳稻品種日本晴(Nipponbare)中鑒定到9個HKT成員，其中5個為亞族Ⅰ成員：OsHKT1;1主要在葉片韌皮部表達(dá)，受鹽脅迫的顯著誘導(dǎo)，還受轉(zhuǎn)錄因子如MYBc等的調(diào)節(jié)[70]；OsHKT1;3在葉、葉鞘及莖基部維管束中均有表達(dá)，在韌皮部中的表達(dá)量很高；OsHKT1;4主要在地上部維管束組織中表達(dá)[64]；OsHKT1;5在根部和葉鞘木質(zhì)部薄壁細(xì)胞膜上均有表達(dá)，在成熟葉片韌皮部中也可觀測到表達(dá)，受鹽脅迫的誘導(dǎo)[71]。亞族Ⅱ成員OsHKT2;1在水稻葉片的維管組織、近軸表皮和葉肉細(xì)胞中均可觀測到表達(dá)[64,72-73]。水稻Nona Bokra品種No-OsHKT2;2/1主要在根中表達(dá)，受外界高Na+濃度的顯著誘導(dǎo)[67]。OsHKT2;3水稻在根、莖基部、葉和葉鞘中均有表達(dá)。OsHKT2;4則在水稻根表皮細(xì)胞及莖、節(jié)間、葉鞘的維管束木質(zhì)部和韌皮部中均有表達(dá)[74]。

2.3 功能及調(diào)控

HKT家族亞族Ⅰ成員多為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但一些成員也具有K+轉(zhuǎn)運(yùn)特性(表3)。擬南芥athkt1;1突變體中的Na+內(nèi)流不受鹽脅迫影響，但鹽脅迫引起體內(nèi)Na+的分配發(fā)生改變，Na+更多地積累在植株的地上部中，且地上部中韌皮部Na+含量下降，而木質(zhì)部Na+含量增加[75]。Zhang等[76]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌GB03通過抑制擬南芥根中AtHKT1;1的表達(dá)降低整株的Na+積累。最近的研究表明，鹽脅迫下，AtHKT1;1通過莖中木質(zhì)部汁液Na+的回流，減少Na+向花器官的運(yùn)輸，從而提高植株的耐鹽性[77]。Busoms等[78]進(jìn)一步的研究表明，AtHKT1;1的演化在擬南芥適應(yīng)動態(tài)變化的鹽濃度過程中起著至關(guān)重要的作用，兩種具有不同表達(dá)模式的AtHKT1;1是使得各種擬南芥生態(tài)型在不同鹽濃度條件下生存的最直接因素?？梢?，AtHKT1;1參與擬南芥Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)態(tài)平衡過程。此外，擬南芥sos3突變體中AtHKT1;1的突變可顯著緩解低K+脅迫下sos3根生長受抑的表型，而AtHKT1;1的超表達(dá)使其生長受抑更為顯著，表明，AtHKT1;1也可能參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)K+穩(wěn)態(tài)平衡[79]。 鹽芥TsHKT1;2與AtHKT1;1有較高的同源性， 但它僅具有K+轉(zhuǎn)運(yùn)特性， 赤桉EcHKT1;2與TsHKT1;2類似。玉米ZmHKT1功能缺失后會引起木質(zhì)部Na+濃度的增加，導(dǎo)致根向地上部Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的增加，表明ZmHKT1可促進(jìn)葉中Na+的外排及木質(zhì)部中Na+的卸載，從而維持植株的耐鹽性[61]。Han等[59]對西藏野生大麥的研究表明，HvHKT1;1基因的敲除會引起根系和葉片中的Na+積累增加，而將HvHKT1;1過表達(dá)在鹽敏感擬南芥hkt1;4和sos1-12突變株中，可顯著降低根和地上部中的Na+含量，表明，HvHKT1;1在根中Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。HKT家族亞族Ⅱ成員不僅具有K+∶Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)特性，在外界環(huán)境的影響下，還可作為K+、Na+單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(表3)。小麥TaHKT2;1屬于K+∶Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)外界Na+濃度較低時，同時介導(dǎo)K+、Na+吸收，是一種Na+藕聯(lián)的K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但當(dāng)外界低K+高Na+時，僅介導(dǎo)低親和性Na+吸收[80]。Laurie等[81]將TaHKT2;1以反義方式轉(zhuǎn)進(jìn)小麥，在低K+和高Na+下檢測膜的去極化，發(fā)現(xiàn)低K+下轉(zhuǎn)基因植株和對照株沒有差異，而高Na+轉(zhuǎn)基因植株比對照去極化程度快，且高Na+(200 mmol·L-1)處理下，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)積累的Na+含量降低，耐鹽性遠(yuǎn)高于對照，進(jìn)一步表明小麥根中TaHKT2;1主要介導(dǎo)Na+內(nèi)流。相似地，在爪蟾卵母細(xì)胞中，水稻OsHKT2;1僅在外界毫摩爾Na+(mmol·L-1)濃度范圍內(nèi)發(fā)揮Na+∶K+共轉(zhuǎn)運(yùn)活性，當(dāng)外界Na+濃度較高時，只轉(zhuǎn)運(yùn)Na+[72,68]。然而，在酵母中表達(dá)時，OsHKT2;1僅表現(xiàn)出轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的特性[67]。水稻缺失OsHKT2;1的突變體中22Na+同位素吸收實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型對比，突變體中根系Na+內(nèi)流明顯下降，且30 mmol·L-1Na+處理使OsHKT2;1調(diào)節(jié)的Na+內(nèi)流下降，同時其表達(dá)水平相應(yīng)下調(diào)，表明OsHKT2;1參與Na+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，是高親和性Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對K+有較強(qiáng)的敏感性[82]。水稻OsHKT2;1和OsHKT2;2的氨基酸序列同源性高達(dá)91%，OsHKT2;2被證明是K+∶Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在耐鹽水稻品種(Nona Bokra)中鑒定到的OsHKT2;2/1，在酵母和爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)，具有很強(qiáng)的K+∶Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)特性，在鹽脅迫下可能參與K+的選擇性吸收，使得Nona Bokra具有較強(qiáng)的耐鹽性[67]。類似地，蘆葦PhaHKT2;1參與鹽脅迫下K+吸收的調(diào)控，控制體內(nèi)離子平衡[83]。此外，Rosas-Santiago等[63]發(fā)現(xiàn)，OsHKT1;3和OsCNIH1的編碼蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)互作，介導(dǎo)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的物質(zhì)運(yùn)輸。Zhang等[74]的研究進(jìn)一步表明，高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsHKT2;4可作為低親和性Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與高濃度Mg2+條件下的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

3 Shaker通道

3.1 結(jié)構(gòu)特征和分類

Shaker家族是第一個在分子水平上被確定的植物K+通道，它是通過酵母吸鉀雙突變體互補(bǔ)法從擬南芥cDNA文庫中分離出來的[91-92]。Sentenac等[91]和Anderson等[92]從擬南芥中首次克隆到K+通道基因KAT1和AKT1。Chérel等[93]進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，KAT1和AKT1與動物K+通道的功能和結(jié)構(gòu)相似。Shaker家族可劃分為5個亞族[94]。亞族Ⅰ和Ⅱ由5個內(nèi)整流K+通道組成(AKT1，SPIK，AKT6，KAT1和KAT2)，亞族Ⅰ和Ⅱ的成員可通過結(jié)構(gòu)上是否含有錨蛋白區(qū)和C末端得以區(qū)分。亞族Ⅲ由單一的成員AKT2組成，含有錨蛋白區(qū)。亞族Ⅳ由單一成員AtKC1組成，不含錨蛋白區(qū)域。亞族Ⅴ由兩個外整流K+通道GORK和SKOR組成，受激活的電壓范圍和整流特性與內(nèi)整流通道相反，含有錨蛋白區(qū)域。

Shaker通道是多亞基蛋白，由4個ɑ-亞基組成。在四聚物結(jié)構(gòu)中，這4個亞基可以是一個Shaker基因的產(chǎn)物，也可以是不同Shaker基因的產(chǎn)物。這些亞基擁有確定的位置，每一個亞基由6個跨膜結(jié)構(gòu)(TM1-TM6)組成疏水區(qū)域，含有N-和C-末端區(qū)域[91]。TM5和TM6之間含有一個高度保守呈β發(fā)夾狀的P環(huán)結(jié)構(gòu)。P環(huán)結(jié)構(gòu)作為離子介導(dǎo)中心選擇性過濾區(qū)域，其所特有的TxxTxGYGD/E正是K+通道標(biāo)志性序列，該結(jié)構(gòu)對于K+具有高度選擇性(表1)[93]。TM4由帶正電荷的氨基酸殘基組成，能感應(yīng)跨膜電壓的變化，進(jìn)而控制內(nèi)整流K+通道的開閉[95]。C-末端在胞質(zhì)內(nèi)，主要由環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域(cNMP)、錨蛋白(ankyrin)重復(fù)域和富含疏水酸性殘基區(qū)(KHA domain)組成[96]。

3.2 定位和組織表達(dá)

Shaker家族大部分成員均定位在質(zhì)膜上。亞族Ⅰ的成員如擬南芥AtAKT1、霸王(Zygophyllumxanthoxylum)ZxAKT1、葡萄VvK1.1、番茄LKT1、胡蘿卜(Daucuscarota)DKT1、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)SsAKT1等均定位在根的質(zhì)膜上，并主要在根表皮細(xì)胞中表達(dá)[17,97](表4)。在其他部位也可發(fā)現(xiàn)該亞族成員Ⅰ的表達(dá)，如在下胚軸、葉原基細(xì)胞、水孔和保衛(wèi)細(xì)胞中可觀測到AtAKT1的表達(dá)[98]，在葡萄的根皮層、花、果實和種子中都有VvK1.2表達(dá)[99]，從玉米胚芽鞘中分離出的ZMK1，在根皮層、花粉中也均有表達(dá)[100]。然而，AtSPIK和AtAKT6主要在擬南芥花中表達(dá)，馬鈴薯(Solanumtuberosum)SKT1卻僅在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)[101-102]。霸王ZxAKT1優(yōu)先在根中表達(dá)，受介質(zhì)中高濃度KCl或NaCl的誘導(dǎo)[103]。亞族Ⅱ的成員擬南芥AtKAT1定位在子葉和下胚軸的保衛(wèi)細(xì)胞中，在黃化下胚軸皮層、表皮和花莖中也有分布，而AtKAT2特異地分布在子葉和黃化幼苗頂端的韌皮部中，AtKAT1和AtKAT2的表達(dá)均受植物激素的顯著誘導(dǎo)。類似地，甜瓜(Cucumismelo)MIRK、玉米ZmK2.1和KZM2等[4]亞族Ⅱ的成員特異地表達(dá)在韌皮部中，在植物的地上部組織中(如莖、葉和花)表達(dá)。亞族Ⅲ的成員幾乎都在韌皮部表達(dá)，如擬南芥AtAKT2、蠶豆(Viciafaba)VFKT1和楊樹PTK2等[101,104]。單子葉植物中，關(guān)于亞族Ⅲ基因成員表達(dá)模式分析的研究報道很少，其中玉米ZMK2被報道在胚芽鞘、中胚軸和葉中表達(dá)，也表現(xiàn)出韌皮部的表達(dá)特性[105]。除了擬南芥AtKC1，在胡蘿卜中也已經(jīng)鑒定到KDC1，這兩個基因都屬于亞族Ⅳ成員，在根皮層尤其根毛中有高表達(dá)[106-107]。亞族Ⅴ的成員具有不同的表達(dá)模式，如擬南芥AtSKOR在根中柱組織和花粉中表達(dá)[102]；擬南芥AtGORK則在保衛(wèi)細(xì)胞、根毛和下胚軸中表達(dá)[108]；玉米ZORK在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)[109]；楊樹PTORK在保衛(wèi)細(xì)胞、葉片木質(zhì)部中都觀察到了表達(dá)[110]；ZxSKOR在霸王的根、莖和葉中都有表達(dá)，其中在根中的表達(dá)量最高，受Na+的顯著誘導(dǎo)[111]。

3.3 功能及調(diào)控

Shaker選擇性K+通道受電壓調(diào)控，根據(jù)受激活的電壓范圍及整流特性，可分為3類：內(nèi)向整流通道(inward rectifier，IR)(包括Ⅰ、Ⅱ亞族)、弱內(nèi)向整流通道(weak inward rectifier，WIR)(包括第Ⅲ亞族)和外向整流通道(outward rectifier，OR)(包括亞族Ⅴ)[112]。亞族Ⅰ和Ⅱ成員受反向電壓激活，具有低K+轉(zhuǎn)運(yùn)親和性，且大部分成員的K+轉(zhuǎn)運(yùn)活性受pH值調(diào)節(jié)，外部介質(zhì)的酸化會增加電流水平和電導(dǎo)率[93]。亞族Ⅰ的一些成員允許NH4+進(jìn)入，尤其在低K+環(huán)境中這種滲透性會引起NH4+和K+的競爭性吸收[113]。研究表明，擬南芥SPIK和水稻OsAKT1均表現(xiàn)出重要的NH4+滲透能力[102,112]。對亞族Ⅱ的3個成員進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)的pH酸化會增加電流，從而改變通道被激活的閾值[114]。亞族Ⅲ的成員需要外界供K+來激活通道，Rb+或Cs+在一定程度上可代替K+。該族成員也對pH敏感，但不同于亞族Ⅰ和Ⅱ的是，外界酸化會降低K+電流和電導(dǎo)率，如擬南芥AtAKT2，楊樹PTK2，玉米ZMK2[105，115]。此外，外界高濃度的Ca2+會引起亞族Ⅲ成員的電壓依賴受阻[115]。亞族Ⅳ在功能上被認(rèn)為是“沉默型”調(diào)控亞族，目前僅擬南芥AtKC1和蘿卜KDC1完成了功能鑒定[116-117]。實際上，AtKC1自身不具有K+通道活性，成員雖不能通過相互作用形成質(zhì)膜多聚體通道，卻可作為負(fù)向調(diào)控元件，與亞族Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的成員一起形成內(nèi)整流雜聚肽通道[118]。與自身通道相比，與其他成員形成雜聚肽通道的電壓激活閾值為反向，且最大電導(dǎo)率都比對應(yīng)的同聚體低，從而降低AKT1的電壓依賴性進(jìn)而抑制AKT1介導(dǎo)的K+內(nèi)流[118]。擬南芥突變體中用電壓鉗分析表明，AKT1同聚體對Rb+的滲透性極其微弱，然而AtKC1-AKT1雜聚肽通道則相反，表明AtKC1亞單元在雜聚肽通道中出現(xiàn)時會影響通道的離子選擇性[119]。Wang等[120]的電生理結(jié)果表明，在擬南芥響應(yīng)低K+的過程中，與野生株相比，AtKC1D突變體(功能獲得性突變體，K+吸收能力提高)中AtAKT1活性被抑制，通過AtAKT1滲出的K+顯著降低，進(jìn)一步揭示，在低K+條件下，AtCIPK和AtKC1協(xié)同調(diào)控AtAKT1介導(dǎo)的K+吸收。KDC1在調(diào)控Zn2+內(nèi)流中作為正向調(diào)控元件，但和亞族Ⅱ的KDC2組成的復(fù)合體卻能負(fù)向調(diào)控通道激活電壓閾值[117]。除亞族Ⅳ外，其他亞族自身或互相作用也能構(gòu)成雜聚肽通道，且與四聚體相比，優(yōu)先形成雜聚肽通道，如擬南芥中，保衛(wèi)細(xì)胞中的亞族Ⅱ成員AtKAT1和AtKAT2，韌皮部細(xì)胞中的亞族Ⅲ成員AtAKT2和AtKAT2[121-122]。亞族Ⅴ對外界K+具有很強(qiáng)的電壓門控敏感性，其激活的電壓閾值受K+平衡潛能Ek影響，根據(jù)輕微的反向膜電壓確定，確保通道正常釋放K+。亞族Ⅴ成員具有較低的離子選擇吸收能力。擬南芥AtSKOR通道中，K+、Cs+和Rb+都可以調(diào)控通道激活閾值，允許外界低濃度Ca2+的大量通過[123]。楊樹PTORK和煙草(Nicotianatabacum)NTORK1可介導(dǎo)除K+外的其他離子通過通道[115,124]。雖然亞族Ⅴ的成員是否能在相同組織中共同表達(dá)尚不清楚，至少擬南芥AtSKOR和AtGORK可以相互作用形成雜聚肽通道[125]。

很多研究表明，大量調(diào)控因子參與質(zhì)膜中植物Shaker通道的調(diào)控或活性激活過程，包括β-亞基、14-3-3蛋白、不同種類的激酶、磷酸酶和SNAREs等[1]。擬南芥中，應(yīng)對鹽脅迫和K+缺失的信號網(wǎng)絡(luò)中，有26個絲氨酸/蘇氨酸CIPKs(protein kinases)和10個CBLs(calcineurin B-like)參與植物對環(huán)境信號的響應(yīng)[10]。Ca2+與CBLs的結(jié)合需要CIPK-CBL的相互作用才能完成。上游的CBL1和CBL9可與CIPK23相互作用，將CIPK23錨定于細(xì)胞質(zhì)膜上，隨后CIPK23對Shaker K+通道AKT1進(jìn)行磷酸化，激活A(yù)KT1的K+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，促進(jìn)植物在低K+條件下吸收K+[126]。Lee等[127]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，由AKT1介導(dǎo)的K+吸收還受CBL1、CBL2、CBL3、CBL9與CIPK家族(CIPK6和CIPK16的錨蛋白結(jié)合域)相互作用的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，爪蟾卵母細(xì)胞中，CIPK-CBL復(fù)合體能夠通過控制AKT1的磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié)AKT1的活性。最近的研究表明，AtKC1和AtCIPK23協(xié)同調(diào)控擬南芥低K+條件下AKT1的活性[128]。AKT2也受磷酸化和去磷酸化的調(diào)節(jié)，AKT2的磷酸化狀態(tài)對其通道活性至關(guān)重要，磷酸化可顯著增強(qiáng)其在韌皮部介導(dǎo)K+轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，參與該磷酸化過程的蛋白激酶仍不清楚[129]。CBL4-CIPK6復(fù)合體可通過促進(jìn)AKT2錨定在質(zhì)膜上從而調(diào)節(jié)AKT2的活性，與AKT1通道不同，該過程依賴激酶的相互作用，不受磷酸化調(diào)節(jié)[130]。爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)亞族Ⅰ成員時，共同表達(dá)擬南芥CIPK23-CBL1(CBL9)復(fù)合體可使該通道從靜默狀態(tài)被激活[131]。楊樹PeCIPK24和PeCBL1可以互相作用，影響通道的錨蛋白區(qū)域和CIPK的激酶區(qū)域[127]。葡萄中，兩個不同的CIPK-CBL復(fù)合體(VvCIPK04和VvCBL01，VvCIPK03和VvCBL02)均誘導(dǎo)了VvK1.2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[99]。可見，亞族Ⅰ通道受CIPK-CBL復(fù)合體調(diào)控的機(jī)制在不同植物種類中均很保守。

相同亞族成員在不同的植物種類中具有不同的生理功能。Ahmad等[132]對比了水稻OsAKT1缺失突變體和超表達(dá)突變體后發(fā)現(xiàn)，OsAKT1的過表達(dá)可以顯著增加水稻組織中尤其是根中的K+含量，從而提高水稻的滲透調(diào)節(jié)能力，以抵御干旱脅迫。經(jīng)異源表達(dá)系統(tǒng)鑒定，玉米ZmK2.1受外界K+濃度的強(qiáng)烈調(diào)節(jié)，與膜的超級化無關(guān)，在外界Km值15 mmol·L-1左右時轉(zhuǎn)運(yùn)活性被激活，無論膜電位如何，均不參與亞微摩爾級的K+吸收[133]。研究表明，玉米保衛(wèi)細(xì)胞中還存在如ZMK2類不受外界K+濃度影響的內(nèi)整流K+通道，這樣玉米保衛(wèi)細(xì)胞可在較大的K+濃度范圍內(nèi)對K+產(chǎn)生響應(yīng)[134]。然而，擬南芥的保衛(wèi)細(xì)胞中僅有KAT1內(nèi)整流K+通道基因表達(dá)。可見，不同植物保衛(wèi)細(xì)胞中內(nèi)整流K+通道的多樣性會引起它們功能方面產(chǎn)生很大差異。耐鹽甜瓜品種中，內(nèi)整流K+通道MIRK在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，其介導(dǎo)的K+電流受外界Na+的抑制，從而影響鹽脅迫下的K+轉(zhuǎn)運(yùn)[135]。此外，MIRK可能通過Na+引起的氣孔開閉控制Na+向地上部組織中的運(yùn)輸，表明內(nèi)整流K+通道可能參與保衛(wèi)細(xì)胞中除調(diào)控氣孔開閉以外的其他重要生理過程[136]。

4 不同植物體內(nèi)K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的比較

Nieves-Cordones等[9]對比分析了擬南芥和水稻體內(nèi)的K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)過程：擬南芥體內(nèi)參與K+吸收的主要成員是AtHAK5和AtAKT1，AtKUP7也可介導(dǎo)K+吸收，K+向木質(zhì)部的釋放主要由AtSKOR介導(dǎo)，AtKUP7在此過程中也可發(fā)揮一定的作用；水稻體內(nèi)OsAKT1、OsHAK1和OsHAK5共同參與K+的吸收，此外，這3類轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能直接或間接發(fā)揮作用，促進(jìn)K+向木質(zhì)部的釋放。ZxAKT1參與霸王體內(nèi)主要的K+吸收過程，ZxSKOR參與霸王體內(nèi)K+的長距離運(yùn)輸，在鹽脅迫下，當(dāng)霸王體內(nèi)ZxAKT1被干擾掉之后，ZxSKOR的表達(dá)顯著下降，且ZxSOS1、ZxHKT1;1、ZxNHX在根和地上部中的表達(dá)均顯著下降，表明ZxAKT1不僅在霸王的K+吸收過程中發(fā)揮重要作用，還參與調(diào)控Na+的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)[103, 111]?？梢?，不同植物體內(nèi)存在特有的K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，且系統(tǒng)內(nèi)各成員之間可產(chǎn)生相互影響。

5 展望

KT/HAK/KUP家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、HKT家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Shaker通道是參與植物體內(nèi)K+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白和通道，目前，已從多種植物中展開了相關(guān)蛋白的作用機(jī)理和調(diào)控機(jī)制研究，但仍有許多問題尚未解決。如：其一，雖然研究表明HKT家族在植物K+、Na+轉(zhuǎn)運(yùn)平衡的過程中具有重要的生理功能，但對其作用機(jī)制尚無定論，且不同物種間存在顯著差異。對于這一問題，今后在深入挖掘基因功能的同時，應(yīng)著重加強(qiáng)不同植物之間的共性和特異性分析。其二，KT/HAK/KUP家族成員的結(jié)構(gòu)目前還不清楚，成員是否參與植物細(xì)胞中K+信號傳遞和區(qū)域化也屬未知，且多基因家族中，想要全面認(rèn)識其功能需要進(jìn)一步研究，成員之間功能上的協(xié)作關(guān)系是否存在，如果確實存在，那協(xié)同如何發(fā)生及協(xié)同作用對植物生理功能的影響都是非常值得探討的問題。其三，Shaker通道的基因受上下游響應(yīng)基因和外界各種因素的調(diào)節(jié)，充分了解成員的表達(dá)模式與生理功能為上游調(diào)節(jié)基因的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究可提供很好的途徑。因此，建議通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、全基因組甲基化學(xué)等方法系統(tǒng)深入的研究植物體內(nèi)K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，加大對相關(guān)基因生理功能的探究；從具有代表性的不同類型植物中展開相關(guān)基因的研究，通過基因沉默、過表達(dá)等方法進(jìn)行功能的深入驗證，為作物遺傳改良提供理論依據(jù)；建議推動建立相關(guān)的專用數(shù)據(jù)庫，將學(xué)者們對K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的序列特征、表達(dá)模式、功能和調(diào)控等的研究成果進(jìn)行綜合整理，以便得到更好地理解和應(yīng)用。