姜黃素-PLGA納米粒的制備及誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

胡興華，張峻槐，黃禮義，徐忠燁

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1. 神經(jīng)外科、2.康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶 400010)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的45%[1]。目前，腦膠質(zhì)瘤的主要治療方式為手術(shù)、放療和化療[2]，然而這些治療手段并不能完全消除腫瘤，且創(chuàng)傷大、副作用明顯。手術(shù)切除的方式能夠治愈小部分低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者，但是，大部分的腦膠質(zhì)瘤患者在接受手術(shù)、輔以放化療等綜合治療后仍易復(fù)發(fā)。腦膠質(zhì)瘤的總體療效有待進(jìn)一步提高，尋找安全有效且毒副作用小的抗腫瘤方法迫在眉睫。

姜黃素(curcumin，CUR)是從姜科植物中提取的一種相對(duì)分子質(zhì)量小的黃色多酚類物質(zhì)，是姜黃的主要成分。大量的研究證明，姜黃素具有抗癌、抗氧化、抗炎、清除自由基等多種藥理作用，并且對(duì)多種惡性腫瘤，如肺癌[3]、前列腺癌[4]、宮頸癌[5]、乳腺癌[6]等均有不同程度的抑制作用，與傳統(tǒng)化療藥物相比毒副作用更小，使其成為極具潛力的抗腫瘤藥物，美國(guó)國(guó)立腫瘤所已將其列為第3代化學(xué)防癌藥[7]。但是，姜黃素存在水溶性差、難吸收、易降解、代謝快等缺點(diǎn)，導(dǎo)致其生物利用度低[8]，使其在基礎(chǔ)和臨床中的應(yīng)用受阻。近年來，可生物降解聚合物在藥物的控制和靶向傳遞中發(fā)揮了重要作用，目前研究較多的合成生物降解聚合物之一的乳酸-乙醇酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]是一種有機(jī)高分子化合物，具有良好的生物相容性和安全性，其優(yōu)良的成囊和成膜性能為藥物傳遞系統(tǒng)提供了良好的支持，大量基于PLGA的藥物傳遞系統(tǒng)已經(jīng)被報(bào)道用于治療或診斷各種疾病。為了改善姜黃素的生物利用度，本實(shí)驗(yàn)采用PLGA作為原材料制備姜黃素-PLGA納米粒，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并觀察其對(duì)鼠源性膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和人源性膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的抗腫瘤作用，期望為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 鼠源性膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株、人源性膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株，由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。高糖DMEM，購自美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素、二甲基亞砜(DMSO)、CCK-8試劑盒、Hoechst 33342，購自上海碧云天生物公司；胎牛血清，購自德國(guó)PAN生物公司；姜黃素、PLGA、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)，購自美國(guó)Sigma公司；二氯甲烷，購自成都市科隆化學(xué)品有限公司； Annexin V-FITC/PI，購自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2儀器 VCY-500聲震儀(上海研永超聲設(shè)備有限公司)；恒溫磁力攪拌器、SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；動(dòng)態(tài)光散射激光粒度測(cè)定儀(英國(guó)Malvern公司)；Varioskan LUX酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；H-7500透射電子顯微鏡(TEM，日本Hitachi公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組U251細(xì)胞株、C6細(xì)胞株均使用添加有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、姜黃素組和姜黃素-PLGA(100 μmol·L-1)組。待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，姜黃素-PLGA組加入含姜黃素-PLGA納米粒的新鮮培養(yǎng)基，姜黃素組加入含姜黃素的新鮮培養(yǎng)基，空白對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，數(shù)小時(shí)后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.3 姜黃素-PLGA納米粒的制備分別稱取50 mg PLGA、2 mg姜黃素，溶于2 mL二氯甲烷中，超聲波清洗機(jī)溶解；加入5 mL預(yù)冷的4% PVA，混勻，在冰水浴條件下超聲乳化2 min(150 W，5 s/5 s)；將乳化后的溶液在通風(fēng)櫥中磁力攪拌2 h，使有機(jī)溶劑二氯甲烷充分揮發(fā)，離心沉淀即姜得黃素-PLGA納米粒。

1.4 姜黃素-PLGA納米粒的表征取適量姜黃素-PLGA納米粒溶液，蒸餾水適當(dāng)稀釋，于常溫條件下固定激光波長(zhǎng)為632.8 nm、散射角90°，使用動(dòng)態(tài)光散射激光粒度測(cè)定儀(dynamic light scattering，DLS)檢測(cè)納米粒的粒徑。倒置熒光顯微鏡觀察姜黃素-PLGA納米粒的形態(tài)。透射電鏡觀察姜黃素-PLGA納米粒的形態(tài)，取適量姜黃素-PLGA納米粒溶液滴于覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，用濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸除多余液體，滴入2%磷鎢酸染色，自然晾干2 d，置于TEM中，以100 kV加速電壓檢視、拍照。多功能酶標(biāo)儀測(cè)定姜黃素及姜黃素-PLGA納米粒的吸收波長(zhǎng)。

1.5 姜黃素-PLGA納米粒的載藥量及包封率測(cè)定多功能酶標(biāo)儀測(cè)定姜黃素濃度：取1 mg姜黃素溶于DMSO中，梯度稀釋為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·L-1，離心洗滌姜黃素-PLGA納米粒時(shí)，收集上清，將上述濃度的姜黃素溶液和收集的上清加入96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，測(cè)定421 nm下各孔的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中姜黃素的含量。應(yīng)用下列公式計(jì)算：包封率/%=(姜黃素總量-上清中姜黃素含量)/姜黃素總量×100%；載藥率=(姜黃素總量-上清中姜黃素含量)/PLGA總量×100%。

1.6 熒光顯微鏡觀察C6細(xì)胞、U251細(xì)胞對(duì)姜黃素-PLGA納米粒的攝取C6細(xì)胞、U251細(xì)胞接種于6孔板(5×105個(gè)/孔)，各組分別接受上述干預(yù)措施處理24 h后，使用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗滌2次后加入0.1% Triton X-100破膜5 min，再用PBS洗滌2次后，使用10 mg·L-1Hoechst 33342染色5 min，洗掉染色液后滴加抗熒光淬滅封片液，使用熒光顯微鏡觀察并照相。

1.7 CCK-8檢測(cè)姜黃素-PLGA納米粒對(duì)C6細(xì)胞、U251細(xì)胞的細(xì)胞毒性將C6細(xì)胞、U251細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，經(jīng)上述分組處理后避光孵育24 h，每孔加入100 μL含10% CCK-8試劑的無血清高糖DMEM培養(yǎng)基避光培養(yǎng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的OD值。陰性對(duì)照組為含CCK-8試劑的無血清高糖DMEM培養(yǎng)基和細(xì)胞，空白對(duì)照組為含CCK-8試劑的無血清高糖DMEM培養(yǎng)基，不含細(xì)胞和毒性物質(zhì)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.8 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率將C6細(xì)胞、U251細(xì)胞種于6孔板中(1×105個(gè)/孔)，經(jīng)上述分組處理24 h后，收集所有的懸浮和貼壁細(xì)胞于EP管中，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，重懸后采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞凋亡將C6細(xì)胞、U251細(xì)胞接種于6孔板(5×105個(gè)/孔)，各組分別接受上述干預(yù)措施處理24 h后，使用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗滌后加入0.1% Triton X-100破膜5 min，PBS洗滌后，使用10 mg·L-1Hoechst 33342染色5 min，洗掉染色液后滴加抗熒光淬滅封片液，使用熒光顯微鏡觀察并照相。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素-PLGA納米粒的表征姜黃素-PLGA納米粒呈黃色，倒置熒光顯微鏡下和透射電鏡下觀察姜黃素-PLGA納米粒呈球形(Fig 1A、1B)，其平均粒徑為(284.6±9.0)nm(Fig 1C)，其吸收波長(zhǎng)為421 nm(Fig 1D)，而姜黃素的吸收波長(zhǎng)為421 nm，證明PLGA成功包載了姜黃素。

2.2 姜黃素-PLGA納米粒的包封率和載藥率姜黃素-PLGA納米粒的包封率為(70.712±2.615)%，載藥率為(2.828±0.105)%。

2.3 細(xì)胞對(duì)姜黃素-PLGA納米粒的攝取如Fig 2所示，姜黃素、姜黃素-PLGA納米粒孵育細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，C6細(xì)胞和U251細(xì)胞對(duì)姜黃素-PLGA納米粒的攝取均明顯多于姜黃素(P<0.05)。

2.4 姜黃素-PLGA納米粒對(duì)C6細(xì)胞、U251細(xì)胞的細(xì)胞毒性CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 3)，24 h時(shí)姜黃素-PLGA組(100 μmol·L-1)的C6細(xì)胞及U251細(xì)胞活性明顯低于空白對(duì)照組和姜黃素組(P<0.05)。

2.5 姜黃素-PLGA納米粒促進(jìn)C6細(xì)胞、U251細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(Fig 4)，經(jīng)上述分組處理24 h后，姜黃素-PLGA組C6細(xì)胞及U251細(xì)胞的凋亡率明顯高于空白對(duì)照組及姜黃素組(P<0.05)；而空白對(duì)照組與姜黃素組對(duì)比，細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞凋亡Hoechst 33342染色結(jié)果顯示(Fig 5)，經(jīng)上述干預(yù)措施處理24 h后，與空白對(duì)照組相比，姜黃素-PLGA組有明顯的細(xì)胞核固縮，深染，凋亡小體形成；與姜黃素組相比，姜黃素-PLGA組也有明顯的細(xì)胞核固縮，深染，凋亡小體形成。結(jié)果表明姜黃素-PLGA納米?？梢哉T導(dǎo)C6細(xì)胞、U251細(xì)胞凋亡。

3 討論

姜黃素作為一種天然酚類物質(zhì)，具有良好的抗腫瘤作用，且安全性好，但是其存在易降解、生物利用度低等不足。PLGA是目前應(yīng)用最廣泛的微膠囊化和延長(zhǎng)治療藥物、蛋白質(zhì)和抗原遞送的生物材料，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域，被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥物管理局(EMA)等國(guó)際監(jiān)管機(jī)構(gòu)普遍認(rèn)為其是安全的。利用腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permea-bility and retention effect,EPR)，包載藥物的PLGA納米?？梢愿玫鼐奂谀[瘤部位，同時(shí)，PLGA能夠延緩肝臟對(duì)藥物的直接代謝，延長(zhǎng)藥物在血液循環(huán)中的存在時(shí)間，提高生物利用度并產(chǎn)生緩釋作用，從而更好地發(fā)揮藥物的治療效率。本研究以PLGA為原材料，采用乳化-溶劑揮發(fā)法成功制備了姜黃素-PLGA納米粒，其大小均勻、粒徑較小，具有良好的生物相容性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于單純的姜黃素，姜黃素-PLGA納米粒能夠更好地被C6細(xì)胞、U251細(xì)胞攝取。在相同藥物濃度下，姜黃素-PLGA納米粒對(duì)C6細(xì)胞、U251細(xì)胞具有更明顯的毒性。

Fig 1 Characterization of curcumin-PLGA nanoparticles

Fig 2 Uptake of curcumin-PLGA nanoparticles in C6 cells and U251 cells(×200)

Fig 3 Effect of curcumin-PLGA nanoparticles on cell viability in C6 cells and U251 cells

凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，其結(jié)果是有序和有效地清除受損細(xì)胞，細(xì)胞凋亡可由細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)(如基因毒性應(yīng)激)或外部信號(hào)(如配體與細(xì)胞表面死亡受體的結(jié)合)觸發(fā)，涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等。凋亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞-細(xì)胞連接消失，核濃縮，核膜核仁破碎，最終將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體。細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持自身穩(wěn)定的重要因素，當(dāng)機(jī)體組織細(xì)胞增殖和凋亡失衡，易引發(fā)腫瘤。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于姜黃素組，姜黃素-PLGA組的細(xì)胞凋亡率明顯增高，并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核固縮、碎裂，表明姜黃素-PLGA納米粒比單純姜黃素更明顯地誘導(dǎo)了C6細(xì)胞、U251細(xì)胞凋亡。

Fig 4 Effect of curcumin-PLGA nanoparticles on cell apoptosis in C6 cells and U251 cells vs control group

Fig 5 Apoptosis in C6 cells and U251 cells induced by curcumin-PLGA nanoparticle(×200)

姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡涉及調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外多種蛋白家族、蛋白分子和不同的分子通路，并且在不同腫瘤中的凋亡機(jī)制也存在差異。既往研究表明，姜黃素可通過凋亡相關(guān)蛋白，如caspase3、caspase-9、Bcl-2、Bcl-xL等，調(diào)控細(xì)胞凋亡[9-12]，也可以通過抑制NF-κB和基質(zhì)金屬蛋白酶-9，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)中制備的姜黃素-PLGA納米粒是否通過上述通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，以及是否存在其他凋亡途徑，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備了一種粒徑較小、大小均一、生物相容性高、可生物降解的姜黃素-PLGA納米粒，并證實(shí)了相比于單純姜黃素，姜黃素-PLGA納米?？擅黠@提高細(xì)胞攝取率，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所、生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院、生命科學(xué)院公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)完成，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室郝蘭、曹陽、李崇雁等老師，以及黃禮義、楊強(qiáng)、鐘曉文等同學(xué)提供的幫助表示衷心感謝！)