外泌體在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的作用研究進展

卞歡，王穎，徐寒梅

（江蘇省合成多肽藥物發(fā)現(xiàn)與評價工程研究中心，江蘇 南京 211198）

外泌體（exosomes）是一種直徑30 ～ 100 nm的囊泡樣小體，由細胞多囊泡體與細胞膜融合時釋放，廣泛存在于細胞內(nèi)和血漿、唾液、尿液、腦脊液、羊水和母乳等體液中[1-2]。外泌體具有脂質雙分子層結構，攜帶多種特異性和非特異性蛋白質、磷脂酸等，以及mRNA、miRNA、lncRNA、siRNA、mtDNA等不同核酸成分，使這些在細胞外液中易失活或降解的組分在體內(nèi)循環(huán)，安全轉移至鄰近和遠端的靶細胞[3]。研究表明：外泌體可以介導細胞間信息交流，這種交流主要通過直接作用于表面信號分子、膜融合后RNAs的胞內(nèi)調節(jié)以及生物活性成分的胞外釋放，具有調控細胞凋亡、產(chǎn)生細胞因子以及調節(jié)免疫等諸多功能[1]。目前已發(fā)現(xiàn)外泌體在癌癥[4]、感染[5]、妊娠并發(fā)癥[6]、自身免疫性疾病和代謝性疾病[6]等多種人類疾病中均發(fā)揮重要作用。

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，包括1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿?。═2DM）、妊娠期糖尿病，以及內(nèi)分泌疾病和病毒感染等引起的其他特殊類型糖尿病。隨著人口老齡化和生活方式的改變，我國糖尿病患病率從1980年的0.67%飆升至2013年的10.4%，截至2017年，我國糖尿病患者數(shù)量已達到1.144億，人數(shù)居全球首位[7]。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生胰島素的胰島β細胞與胰島素敏感組織如大腦、肝臟、脂肪和肌肉等分泌的外泌體能夠轉移至其他代謝器官、免疫細胞以及內(nèi)皮細胞中，可維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)或加重胰島素抵抗（見圖1）[8-9]。本文就胰島β細胞、脂肪組織、肌肉組織、干細胞和血液等來源外泌體對糖尿病發(fā)病機制、診斷和治療等方面的影響作一綜述。

圖 1 糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中外泌體參與細胞組織間通訊的示意圖Figure 1 Schematic diagram of exosomes participating in intercellular communication in the pathogenesis and progression of diabetes mellitus

1 胰島β細胞來源外泌體

胰腺β細胞來源外泌體中富含大量miRNA，可以廣泛調節(jié)胰腺β細胞穩(wěn)態(tài)關鍵基因，是調節(jié)細胞間通信和血糖水平的新介質[10]。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，原代小鼠胰島細胞和胰島細胞系MIN6在高葡萄糖、高KCl、高精氨酸和高游離脂肪酸等不同的胰島素分泌刺激條件下，會產(chǎn)生攜帶不同miRNA的外泌體。生理狀態(tài)下，高水平的血糖會刺激胰島分泌特異性miRNA，如miR-375和miR-223。miR-375在胰腺中特異性表達，可調節(jié)參與激素分泌的基因表達以及響應胰島素抵抗的β細胞群增殖[12-13]，并可通過外泌體轉運至其他組織或器官中；miR-223可以促進骨骼肌和肝組織中的葡萄糖轉運體 4（GLUT4）表達，改善葡萄糖攝取。Guay等[14]研究顯示，胰島β細胞在加入干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）等促炎細胞因子培養(yǎng)之后，產(chǎn)生的外泌體miRNA水平轉移至鄰近β細胞，誘導了細胞凋亡，最終導致T1DM的進展。除了調節(jié)對β細胞應激的生理和病理反應，β細胞來源外泌體還能與免疫細胞相互作用，在糖尿病發(fā)展期間激活或增加β細胞炎癥和破壞自身免疫過程。T1DM往往伴隨著內(nèi)質網(wǎng)（ER）應激現(xiàn)象，細胞因子誘導的ER應激可促進胰腺β細胞外泌體的分泌，外泌體中攜帶谷氨酸脫羧酶65（GAD65）、蛋白酪氨酸磷酸酶2（IA-2）和胰島素原（proinsulin）等自身抗原，同時可誘導免疫刺激伴侶蛋白鈣網(wǎng)蛋白、Gp96和ORP150的釋放，這種攜帶自身抗原和促炎信號組合的胰島β細胞來源外泌體被樹突狀細胞（DC）吞噬后，會激活抗原呈遞功能并活化T細胞，從而啟動T1DM自身免疫反應[15-16]。人類胰島β細胞來源外泌體還能夠將血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）A和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）等的mRNA運送到胰島內(nèi)皮細胞中以傳遞信號，從而促進內(nèi)皮細胞活化和血管生成，同時還有一類被稱為“angiomiRs”的miRNA，包括miR-27b、miR-126、miR-130和 miR-296，它們同樣能夠在內(nèi)皮細胞中通過激活VEGF等生長因子的信號轉導，從而在新血管生成過程中發(fā)揮作用[17]。

2 脂肪組織來源外泌體

肥胖與T2DM有著密切關系，肥胖會導致體內(nèi)產(chǎn)生炎性環(huán)境，誘發(fā)胰島素抵抗[18]，脂肪組織是肥胖狀態(tài)下循環(huán)miRNA的主要來源[19-20]，這些循環(huán)miRNA由外泌體轉運并作用于全身，因此脂肪組織來源的外泌體可以作為近端和遠端組織中新陳代謝的調節(jié)劑，提供了細胞間通信的新機制。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖個體脂肪組織中的外泌體可以通過Toll樣受體4（TLR4）依賴性方式誘導巨噬細胞活化，促進炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌，增強巨噬細胞向脂肪組織和肝臟的遷移，并促進胰島素抵抗的發(fā)展[21-22]。同時脂肪組織也能分泌脂肪組織巨噬細胞來源外泌體（ATM-Exos），肥胖小鼠ATM-Exos作用于正常小鼠時會引起葡萄糖不耐受和胰島素抵抗，相反從正常小鼠獲得的ATM-Exos作用于肥胖小鼠時能改善葡萄糖耐量和胰島素敏感性[23]。Yu等[24]發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞外泌體可通過miR-27a介導抑制過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）及其下游基因Glut4和胰島素受體底物（Irs-1），在骨骼肌細胞中積累并破壞胰島素依賴性葡萄糖攝取，從而誘導骨骼肌胰島素抵抗。脂肪干細胞是一種脂肪組織源性間充質干細胞，其外泌體可以上調炎癥脂肪細胞的瘦素表達[25]，同時將攜帶的活性信號轉導子與轉錄活化子3（STAT3）轉移到巨噬細胞中，從而激活精氨酸酶1（Arg-1），驅使M2巨噬細胞極化，誘導的M2巨噬細胞不僅高表達酪氨酸羥化酶和IL-10，而且還可促進脂肪干細胞增殖和乳酸產(chǎn)生，從而響應高脂肪激發(fā)的白色脂肪棕色化，促進白色脂肪中的免疫和代謝穩(wěn)態(tài)，為肥胖和糖尿病提供潛在的治療手段[26]。心血管疾病是T2DM常見且致命的并發(fā)癥，患者動脈粥樣硬化引起的心肌梗死、卒中、心源性猝死等是主要的死亡原因。Wang等[27]對其發(fā)病機制進行研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗脂肪細胞外泌體可通過Shh信號通路誘導滋養(yǎng)血管增生，增加斑塊負荷，促進斑塊易感性，最終導致動脈粥樣硬化斑塊破裂。對肥胖與非肥胖個體內(nèi)臟脂肪外泌體進行檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪外泌體中的miRNA作用于轉化生長因子β（TGF-β）和Wnt/β-catenin信號通路，而這2種信號通路對纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響，包括肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、心肌纖維化、視網(wǎng)膜纖維增生等[28]。

3 肌肉組織來源外泌體

流行病學研究顯示，耐力運動可以誘導骨骼肌釋放富含多肽和核酸的外泌體進入循環(huán)系統(tǒng)并作用于全身，緩解包括T2DM在內(nèi)多種代謝性疾病的影響，并且外泌體含量會隨著耐力運動強度的上升而增加[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在肌肉生成過程中，C2C12成肌細胞外泌體miRNA參與肌細胞分化的重要信號傳導途徑（如Wnt等）；而肌管外泌體可將miRNA和siRNA轉移到成肌細胞中，沉默成肌細胞去乙?；?（Sirt1）基因并促進其分化，成肌細胞和肌管外泌體相互作用，從而調節(jié)骨骼肌代謝動態(tài)平衡[29]。脂質組學分析顯示，經(jīng)棕櫚酸酯處理的C2C12細胞能夠產(chǎn)生富含棕櫚酸酯的外泌體，該外泌體通過向其他正常肌細胞轉移這種有害的脂質成分，誘導成肌細胞增殖并參與細胞周期調節(jié)和肌肉分化基因的表達，通過“旁分泌樣”信號改變肌肉動態(tài)平衡，并通過骨骼肌外泌體將特定信號轉移至關鍵代謝組織[30]。除了骨骼肌，心肌組織也在糖尿病中起著重要作用，糖尿病患者往往會出現(xiàn)心臟血管生成不足、功能損傷的現(xiàn)象，Wang等[31]發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠心肌細胞外泌體miR-320過表達，該外泌體轉移至心臟內(nèi)皮細胞后，miR-320功能性下調其靶基因胰島素樣生長因子1（Igf-1）、熱休克蛋白20（Hsp20）和人紅血細胞增多癥病毒致癌基因同源體2（Ets2），抑制心臟內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔樣結構形成，從而抗血管生成。另外，該團隊還發(fā)現(xiàn)了心肌細胞外泌體含有低水平的HSP20，可導致小鼠心臟功能障礙、心臟肥大、心肌細胞凋亡和纖維化，引發(fā)心臟不良重構[32]。因此，心肌細胞miR-320和HSP20改造外泌體有望成為潛在的新型糖尿病心肌病治療劑。

4 干細胞來源外泌體

干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，目前Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中已有通過移植人胚胎干細胞來源的胰腺內(nèi)胚層細胞治療T1DM，成功定向分化并產(chǎn)生了功能性胰島樣結構，隨后進一步成熟生長為能夠響應葡萄糖和胰島素變化的β細胞；臨床上還采用臍帶間充質干細胞（MSC）用于T2DM治療，其能夠顯著降低血糖和糖化血紅蛋白水平，減少全身炎癥和T淋巴細胞數(shù)[33]。但干細胞療法存在一些挑戰(zhàn)，如供體匹配情況、低產(chǎn)量和血栓形成等不良作用，所以干細胞來源外泌體治療僅是可能的發(fā)展方向[34]。目前已發(fā)現(xiàn)干細胞來源外泌體可用于修復或預防糖尿病并發(fā)癥造成的損傷，其免疫調節(jié)和修復特性可以保護甚至恢復早期T1DM患者的原始胰島免受自身免疫破壞，并且可能抑制胰島移植的排斥反應[35]。MSC是干細胞家族的重要成員，在體外或體內(nèi)適當誘導條件下，可分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、內(nèi)皮、神經(jīng)、肝、心肌等多種組織細胞，是目前臨床上使用最多的干細胞，人MSC分泌的外泌體可以通過多種渠道在T2DM中發(fā)揮作用（見圖 2）[36]。

因在體內(nèi)毒性較低且穩(wěn)定性較好，具有組織特異性歸巢能力，干細胞來源外泌體逐漸被視為可替代脂質體的新型藥物遞送載體，可以被用于治療劑的體內(nèi)和體外包載，且干細胞的永生化不會影響外泌體產(chǎn)生的數(shù)量或質量，從而能夠實現(xiàn)穩(wěn)定的外泌體工程生產(chǎn)[37]。

圖 2 人間充質干細胞來源外泌體對2型糖尿病的作用示意圖Figure 2 Schematic diagram of effects of human mesenchymal stem cell exosomes on type 2 diabetes mellitus

4.1 骨髓間充質干細胞來源外泌體

骨髓間充質干細胞（BMSC）是目前干細胞治療的首選，被廣泛用于神經(jīng)和組織修復等多種疾病適應證。臨床上已經(jīng)證實，BMSC可以促進內(nèi)源性中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復[34]。Cui等[38]進一步研究了BMSC來源外泌體的神經(jīng)修復效果，結果發(fā)現(xiàn)，其通過miR-145/三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）/人胰島素樣生長因子1受體（IGFR1）通路增加血管和神經(jīng)白質重塑，對T1DM卒中大鼠的神經(jīng)損傷有很好的修復作用。Nakano等[39]發(fā)現(xiàn)，BMSC來源外泌體還可以通過修復海馬CA1區(qū)域中損傷的神經(jīng)元和星形膠質細胞來改善鏈脲佐菌素（STZ）糖尿病小鼠的認知障礙和細胞超微結構異常，是治療糖尿病患者癡呆的潛在方法。另外，BMSC來源外泌體還有助于改善糖尿病腎病，通過調節(jié)細胞間黏附分子1（ICAM-1）、TGF-β1和緊密連接蛋白1（ZO-1）的表達，抑制骨髓來源DC過度滲入腎臟，抑制腎小管間質中的纖維化，并在腎小管上皮細胞中發(fā)揮抗凋亡作用[40]。此外，BMSC外泌體在與外周血單個核細胞（PBMC）共培養(yǎng)時，可以通過抑制PBMC增殖以及增強Treg細胞功能來抑制免疫反應，注射這種外泌體能夠促進胰島功能和抑制免疫排斥，顯著改善胰島移植情況[41]。

4.2 胰島間充質干細胞來源外泌體

已有報道表明：胰島素瘤細胞來源外泌體能夠刺激T1DM模型非肥胖糖尿?。∟OD）小鼠的自身免疫應答[42]。Rahman等[43]基于這一現(xiàn)象進一步研究了初級胰島細胞是否可以產(chǎn)生外泌體，通過分離NOD小鼠胰島進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的胰島能夠產(chǎn)生一種快速復制、具有成纖維細胞樣的胰島間充質干細胞（iMSC），這些iMSC釋放具有高度免疫刺激性的外泌體，可激活小鼠內(nèi)源性自身反應性B細胞和T細胞，促進T細胞的擴增轉移并加速效應T細胞介導的胰島破壞。另有研究發(fā)現(xiàn)，iMSC位于前驅糖尿病正常胰島的周邊，但當淋巴細胞發(fā)生浸潤時就會逐漸滲透到β細胞區(qū)域，釋放攜帶自身抗原的外泌體，從而誘發(fā)自身免疫，作用于DC和B細胞，激活T細胞和巨噬細胞，進而引發(fā)β細胞損傷[44]。iMSC來源外泌體中含有內(nèi)源性逆轉錄病毒（ERV）、囊膜糖蛋白（Env）和核衣殼蛋白（Gag）抗原，異?；蜻^量釋放會誘導自體反應性T細胞產(chǎn)生IFN-γ，激活先天性和適應性免疫，觸發(fā)組織特異性炎癥和自身免疫應答，加速效應T細胞介導的胰島破壞[45]。

4.3 臍帶間充質干細胞來源外泌體

臨床上移植人臍帶間充質干細胞（hucMSC）的T2DM患者顯示出相對穩(wěn)定的血糖水平，一些患者在治療25 ～ 43個月后不再依賴于胰島素。Sun等[36]研究發(fā)現(xiàn)，hucMSC來源外泌體可以通過促進肌肉中GLUT4的表達和膜轉運以及依賴于胰島素的肝糖原儲存來恢復T2DM患者的葡萄糖穩(wěn)態(tài)，抑制STZ誘導的β細胞凋亡，緩解T2DM患者的胰島素分泌功能障礙。糖尿病心肌病是糖尿病患者死亡的重要原因之一，研究顯示hucMSC來源外泌體具有降低糖尿病小鼠血糖和血脂以及改善心臟功能的作用；外泌體中富含miR-22和miR-24，在心肌缺氧復氧的條件下能夠減少心肌細胞凋亡，miR-22通過下調窖蛋白3（Cav-3）表達，進而恢復eNOS活性和NO產(chǎn)生，對缺血再灌注損傷心肌發(fā)揮保護作用，miR-24則可以調節(jié)糖尿病心肌纖維化[46-47]。

4.4 內(nèi)皮祖細胞來源外泌體

糖尿病狀態(tài)下內(nèi)皮祖細胞（EPC）會在1周內(nèi)迅速從凋亡轉變?yōu)閴乃罓顟B(tài)，遷移能力明顯受損，可塑性降低并伴隨趨化因子2（CXCL2）引起的細胞骨架紊亂，四次跨膜超家族膜蛋白63（CD63）、ALG-2相互作用蛋白X（Alix）和Ras相關蛋白（Rab27a）基因下調，從而導致外泌體分泌數(shù)量大幅減少[48]。研究發(fā)現(xiàn)，EPC來源外泌體激活ERK1/2信號通路，可以通過旁分泌刺激血管生成相關分子VEGFA和eNOS等的表達，增強血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管形成，加速皮膚傷口愈合[49-50]。此外，EPC來源外泌體還可以減少C反應蛋白（CRP）和IL-8的表達，抑制T2DM動脈粥樣硬化小鼠血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應，同時減少活性氧簇（ROS），降低丙二醛（MDA）的表達，抑制血管內(nèi)皮細胞的氧化應激，對T2DM動脈粥樣硬化有一定的治療效果[51]。

4.5 其他干細胞來源外泌體

除了上述常見的干細胞，研究人員還發(fā)現(xiàn)一些特殊的干細胞同樣在糖尿病中發(fā)揮作用。人循環(huán)纖維細胞是一類MSC，其外泌體富含HSP90α和STAT3，能夠活化真皮成纖維細胞，誘導角質形成細胞的遷移和增殖，加速糖尿病小鼠體內(nèi)的傷口閉合，可以被用于治療糖尿病潰瘍[52]。尿源性干細胞（USC）來源外泌體高表達惡性腦腫瘤缺失蛋白1（DMBT1），這種蛋白能夠介導內(nèi)皮細胞血管生成，同樣能夠加速糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合和皮膚再生[53]。

5 血液來源外泌體

生物標志物對預測和診斷復雜多因素代謝性疾病如糖尿病具有極其重要的意義，傳統(tǒng)生物標志物如血漿代謝物和細胞因子等已不能可靠地監(jiān)測疾病各個階段，外泌體在機體應激致病環(huán)境下可從多種組織和細胞分泌釋放到血液循環(huán)中，可反映代謝性疾病進程中體內(nèi)功能失調狀態(tài)[54]。血清和血漿外泌體含有大量穩(wěn)定的miRNA，可以作為診斷糖尿病的潛在生物標志物[55]。前驅糖尿病早期階段，血清外泌體水平和外泌體誘導的IFN-γ產(chǎn)生與疾病進展呈正相關，可以用于預測糖尿病的進展情況[43]。在炎癥因子作用下，新發(fā)T1DM患兒的血清外泌體中miR-21-5p水平急劇上升，從而加速β細胞凋亡，這一現(xiàn)象出現(xiàn)在T1DM患者β細胞功能嚴重喪失之前，所以血清外泌體miR-21-5p可能是潛在的T1DM檢測標志物[56]。胰腺移植對傳統(tǒng)治療無效的T1DM患者來說是最佳治療方法，但也存在較高的排異反應風險，所以監(jiān)測免疫排斥非常重要。Vallabhajosyula等[57]在對胰腺移植患者長達5年的隨訪期內(nèi)發(fā)現(xiàn)，受體血漿能夠準確表征供體胰島β細胞特異性外泌體含量及其miRNA與蛋白質組學的變化，這為移植胰腺提供了非侵入性生物標志物。

除了作為生物標志物，血液來源外泌體還與糖尿病的發(fā)病過程有一定的聯(lián)系。脂聯(lián)素能夠調節(jié)糖脂平衡，與T2DM關系密切，Santovito等[58]通過對糖尿病患者和健康人循環(huán)外泌體miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素家族miRNA let-7a和let-7f表達顯著下調，而接受降糖治療后血糖顯著改善的患者會出現(xiàn)循環(huán)let-7a和let-7f水平大幅增加的現(xiàn)象。PPARγ是一種調節(jié)代謝相關基因轉錄的核受體，同樣在糖尿病信號通路中起著重要作用。Looze等[59]發(fā)現(xiàn)，PPARγ存在于血漿來源外泌體中，這為核受體的旁分泌轉移提供了一種潛在的新途徑。另有研究發(fā)現(xiàn)，健康人外周血單核細胞中CD34+細胞亞群會分泌含有angiomiR-126的外泌體，并作用于內(nèi)皮細胞，從而促進血管生成，而這一過程在糖尿病患者體內(nèi)被減弱，這也是糖尿病患者心血管修復功能受損的原因之一[60]。

6 結語

綜上所述，越來越多的證據(jù)表明：外泌體通過將不同分子遞送至鄰近和偏遠組織，在組織特異性和全身代謝的調節(jié)中發(fā)揮重要作用[61]。雖然人們對外泌體與多種疾病的關系已經(jīng)進行了充分研究，但人們對外泌體與糖尿病的關系仍然了解甚少。目前的研究多認為，胰島β細胞和BMSC、iMSC、hucMSC、EPC等多種干細胞來源的外泌體可以調節(jié)β細胞信號傳導，而脂肪組織、肌肉組織等產(chǎn)生的外泌體可以轉移特定的蛋白和核酸到多種胰島素敏感外周組織，從而調節(jié)全身糖脂平衡和炎癥環(huán)境，在糖尿病發(fā)病過程中起著重要作用。另一方面，血液中的循環(huán)外泌體可以作為一種無創(chuàng)液體活檢生物標志物，用于更加高效精確的早期糖尿病診斷以及預后評估指標。

外泌體相較于細胞體積小，更不容易被機體攝取清除，可以攜帶其來源細胞的相關成分，安全地到達靶點發(fā)揮作用，作為細胞治療的延伸，在糖尿病治療中發(fā)揮作用[62]。與此同時，外泌體臨床應用也和細胞治療一樣要經(jīng)歷長期安全性的考驗。外泌體內(nèi)容物不是固定的，與細胞來源、狀態(tài)活力和培養(yǎng)環(huán)境直接相關，所以還需要對穩(wěn)定規(guī)?；饷隗w生產(chǎn)進行深入研究。盡管現(xiàn)在外泌體在糖尿病中的研究還處于起步階段，但隨著理論和技術不斷成熟，外泌體必將在糖尿病領域展現(xiàn)出巨大潛力。