吲哚胺2，3-雙加氧酶-1及其抑制劑的研究進展

葉科，邱亞濤，張婉衡，蔣晟

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)系， 江蘇 南京 210009）

腫瘤免疫治療是指激活機體自身的免疫系統(tǒng)或恢復(fù)被抑制的免疫反應(yīng)來對抗腫瘤的一種新興抗腫瘤療法?！澳[瘤免疫療法”被美國Science雜志評為2013年度十大科技突破之首。該療法的研究取得了突破性進展。特別是，阻斷細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）、程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡受體配體-1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）等增強T細胞抗腫瘤免疫反應(yīng)的免疫檢查點抑制劑，在黑色素瘤、頭頸部腫瘤和霍奇金淋巴瘤等惡性腫瘤中取得了顯著的臨床療效，如美國FDA于2011年批準的針對CTLA-4的單抗ipilimumab以及2014年批準的針對PD-1的單抗nivolumab和pembrolizumab。然而，目前可用的免疫檢查點抑制劑只能使特定的亞群患者受益或?qū)δ承╊愋湍[瘤具有抑制效果，且用藥一段時間后常出現(xiàn)耐藥性[1]；此外這些免疫檢查點抑制劑大多為生物類大分子藥物，具有成本高、生物利用度低、靜脈注射導(dǎo)致病人依從性差等問題。因此，利用小分子藥物自身的優(yōu)良特性，研究與開發(fā)小分子免疫檢查點抑制劑替代大分子生物藥物具有重要意義，而吲哚胺2，3-雙加氧酶-1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1，EC 1.13.11.52）是小分子免疫檢查點抑制劑的潛在有效靶點[2]。正常生理條件下，IDO1在機體中低表達，是催化人體必需氨基酸色氨酸（tryptophan，Trp）經(jīng)過犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）途徑代謝的關(guān)鍵限速酶。然而，IDO1在多種惡性腫瘤中異常高表達，造成腫瘤微環(huán)境中Trp耗竭和Kyn等代謝產(chǎn)物的增加，明顯抑制 T 細胞的增殖，活化調(diào)節(jié)性 T 細胞（regulatory T cell，Treg），抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，使機體無法對腫瘤細胞進行識別和清除。并且，IDO1的高表達與病人的藥物耐藥性、腫瘤發(fā)展進程和預(yù)后差密切相關(guān)[3]。因此，抑制IDO1的活性可以有效地抑制腫瘤微環(huán)境中Trp的降解，促進T細胞的增殖，從而增強機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊能力。另外，IDO1抑制劑還可以增強化療藥物、放療以及治療性疫苗的療效[4-5]。在2017年美國臨床腫瘤學(xué)會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）年會上，IDO1抑制劑被譽為腫瘤免疫治療的下一個熱點研究領(lǐng)域。本文首先簡述IDO1的生理功能、活性調(diào)控機制及其在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮的作用，并對近期IDO1抑制劑研發(fā)過程中面臨的挑戰(zhàn)進行分析，最后對近期IDO1抑制劑的研究進展進行綜述。

1 IDO1的功能、活性調(diào)控機制及其在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮的作用

1.1 犬尿氨酸途徑的限速酶

Trp是一種含有吲哚環(huán)骨架的必需氨基酸，為多種細胞生命活動和正常的生理功能所必需，其體內(nèi)代謝途徑主要有4種：脫羧作用生成色胺、蛋白質(zhì)的合成、血清素途徑和Kyn途徑（見圖1[6]），其中Kyn途徑是體內(nèi)Trp代謝的主要途徑。Kyn代謝途徑的第1步是其限速步驟，即將Trp轉(zhuǎn)化為N-甲酰基犬尿氨酸（N-formylkynurenine，NFK），由IDO1、IDO2（EC 1.13.11）和色氨酸-2，3-雙加氧酶（tryptophan 2，3-dioxygenase，TDO，EC 1.13.11.11）催化裂解Trp吲哚環(huán)的2，3-雙鍵，同時將一個氧分子（O2）融合到此未封閉的分子中完成。NFK在甲酰胺酶的作用下快速轉(zhuǎn)化為Kyn，后者進一步轉(zhuǎn)化為其他活性代謝物，如犬尿胺、3-羥基犬尿氨酸、鄰氨基苯甲酸、犬尿烯酸、3-羥基鄰氨基苯甲酸以及喹啉酸、吡啶酸和可為細胞代謝提供能量的NAD+和 ATP[7-8]。

IDO1、IDO2和TDO雖具有相似的生化作用，但在結(jié)構(gòu)、底物轉(zhuǎn)化率、底物特異性、組織分布和表達調(diào)控等方面均存在不同程度的差異[7]。IDO1是由8p12染色體編碼生成的一種位于細胞質(zhì)內(nèi)的含亞鐵血紅素的單體蛋白，于1967年首次在兔腸道中發(fā)現(xiàn)[9]。IDO1對底物的選擇性較低，能夠識別L-Trp、D-Trp、血清素和色胺等多種底物。該酶主要負責(zé)肝臟外L-Trp的代謝，對L-Trp具有較高的親和力（Km≈ 20 μmol·L-1）。TDO 是 4 號染色體編碼形成的同源四聚體血紅素酶，于1936年首次在兔肝臟中被發(fā)現(xiàn)，對L-Trp具有較高的選擇性，但對底物的親 和 力 比 IDO1 低（Km≈ 190 μmol·L-1）[10-11]。TDO可直接調(diào)節(jié)L-Trp的水平，以維持體內(nèi)L-Trp的穩(wěn)態(tài)。IDO1是由INDO基因所編碼，而TDO則是由TDO2基因編碼，兩序列同源性僅有10%，但二者含有亞鐵血紅素的活性部位相似性很高[12]。IDO2是IDO1的同源物，IDO2由INDOL1基因所編碼，二者的基因位于同一條染色體上，INDOL1位于INDO的下游，二者呈現(xiàn)頭尾相連的排列方式。雖然編碼IDO1與IDO2的基因具有43%的序列同源性，但是IDO2催化降解L-Trp的能力遠低于IDO1（Km≈ 6.8 mmol·L-1）[12-13]。IDO1 在肝臟外各組織中均有分布，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸、胸腺、脾臟、胰腺、胎盤、腎臟、呼吸道、髓細胞和內(nèi)皮細胞等，且在特定的組織中隨著年齡的增長而增加[14]。TDO主要在肝臟、胎盤和大腦中表達，這可能反映了其維持身體能量需求的特殊作用。與IDO1相比，IDO2的分布范圍相對較小，在IDO1表達的部分組織中表達，

主要分布在腎臟中，其次在附睪、睪丸、肝臟、卵巢、子宮、胎盤中有表達[7]。盡管IDO1和IDO2在多種相同組織中表達，但二者分布在不同類型的細胞中，說明二者具有不冗雜的生物學(xué)功能。大量研究表明：IDO1和TDO在多種腫瘤細胞中呈高表達水平，與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)；而IDO2在腫瘤細胞中低表達，因而IDO2是否介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸尚存爭議。雖然3種酶均催化Kyn途徑的關(guān)鍵步驟，但現(xiàn)階段的研究主要集中在IDO1。IDO1被視為最具治療潛力的抗腫瘤靶點之一[15]。

1.2 IDO1的活性調(diào)控機制

IDO1的表達和活性受多種因素的影響，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯和降解等過程。在轉(zhuǎn)錄水平上主要受以下方式調(diào)控：1）核因子活化B細胞κ輕鏈增強子（nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）通路主要涉及機體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞，可通過干擾素通路調(diào)節(jié)IDO1 mRNA的表達；2）CCCTC-結(jié)合因子（CCCTC binding factor，CTCF）是廣泛存在于真核生物中的多功能轉(zhuǎn)錄因子，其可以通過啟動子和遠端增強子區(qū)域間的染色質(zhì)長周期相互作用來介導(dǎo)IDO1的表達[16]；3）特定的樹突狀細胞（dendritic cell，DC）反應(yīng)元件與芳氫受體（aromatic hydrogen receptor，AhR）結(jié)合，促進Kyn依賴性的IDO1的表達[17]。此外，特定的翻譯后調(diào)節(jié)機制也會影響IDO1酶的活性與半衰期，例如可擴散分子一氧化氮（NO）與IDO1的血紅素輔因子結(jié)合后產(chǎn)生的Fe3+和NO3-，會導(dǎo)致酶活性的可逆性抑制。另外，內(nèi)源性NO的產(chǎn)生會促進IDO1的蛋白酶體降解。低氧也會導(dǎo)致INDO基因表達減少，從而減少Kyn的產(chǎn)生[18]。

在蛋白質(zhì)水平上，IDO1主要受免疫原刺激下蛋白酶體降解系統(tǒng)的調(diào)控[8]。IDO1含有2個可磷酸化的酪氨酸殘基（Tyr115和Tyr253），殘基磷酸化會導(dǎo)致IDO1的構(gòu)象變化并阻斷IDO1的催化活性[19]。除了調(diào)節(jié)催化活性外，這些殘基還可作為多種分子伴侶的?？奎c，調(diào)節(jié)IDO1的半衰期，維持其免疫調(diào)節(jié)作用或刺激炎癥反應(yīng)[17]。例如，白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）誘導(dǎo)Tyr253磷酸化，從而募集細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）與IDO1形成復(fù)合物，促進IDO1被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。

圖1 色氨酸代謝途徑Figure 1 Metabolic pathways of tryptophan

1.3 IDO1在免疫逃逸中的作用和機制

正常生理狀態(tài)下，IDO1的表達水平較低，而多種細胞因子可誘導(dǎo)IDO1的表達，包括干擾 素-α（interferon-α，IFN-α）、IFN-γ、 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）、IL-1、前列腺素 E2（prostaglandin-E2，PGE2）、 轉(zhuǎn) 錄 生 長 因 子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)、 腫 瘤 壞 死因子（tumour necrosis factor，TNF），環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2） 等[20]。2002年，F(xiàn)riberg等[21]首次提出IDO1在腫瘤免疫逃逸中具有重要作用。其研究表明在體外Lewis肺癌細胞（Lewis lung carcinoma，LLC）水平，IDO1抑制劑刺激產(chǎn)生了更強的同種異體T細胞反應(yīng)，并在體內(nèi)LLC小鼠模型中延緩腫瘤細胞生長。IDO1在多種腫瘤細胞中異常高表達，與病人生存周期縮短、腫瘤T細胞浸潤減少和Treg增多等不良預(yù)后密切相關(guān)。IDO1介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸是綜合調(diào)節(jié)多種免疫細胞的結(jié)果，其一方面抑制效應(yīng)T細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞等免疫殺傷細胞的活性或誘導(dǎo)其凋亡，另一方面促進Treg、髓性抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）等免疫抑制細胞增殖或誘導(dǎo)激活，兩方面協(xié)同作用產(chǎn)生免疫抑制微環(huán)境，使得腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊。如圖2所示，IDO1主要通過以下3種作用機制介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進腫瘤細胞的增殖和生長[22-24]。

1.3.1 Trp耗竭激活應(yīng)激反應(yīng)激酶通路 IDO1高表達造成局部Trp耗竭，使得轉(zhuǎn)運Trp的tRNA處于游離狀態(tài)，而一般性調(diào)控阻遏蛋白激酶 2（general control non-derepressible 2，GCN2）因含有一個感應(yīng)游離tRNA的變構(gòu)調(diào)節(jié)位點而得到激活。活化的GCN2誘導(dǎo)下游真核細胞轉(zhuǎn)錄起始因子-2α（eukaryotic translation initiation factor- 2α，EIF-2α）磷酸化，從而弱化了EIF-2α的促轉(zhuǎn)錄功能，抑制蛋白質(zhì)合成，進而導(dǎo)致T細胞周期阻滯，抑制浸潤性T細胞活化[25-26]。此外，激活的GCN2也能促進Treg的分化。

1.3.2 Trp耗竭抑制氨基酸感應(yīng)激酶1通路 Trp匱乏抑制氨基酸感應(yīng)激酶1（master amino acid sensing kinase 1，GLK1），進一步抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號分子。mTOR通過蛋白復(fù)合物mTORC1/ mTORC2感受和整合外界生長因子、能量狀態(tài)和營養(yǎng)水平等信息，在生物體生長發(fā)育和細胞自噬等過程中發(fā)揮重要作用。因而當(dāng)mTOR信號受到抑制，可導(dǎo)致T細胞免疫效能下降，誘導(dǎo)T細胞自噬[22,27]。

1.3.3 Kyn結(jié)合并激活芳氫受體通路 AhR是一種應(yīng)對異型生物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，與癌癥以及炎癌轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。Opitz等[28]發(fā)現(xiàn)Kyn是AhR的內(nèi)源性配體，Kyn與AhR結(jié)合后，后者移位至細胞核，與芳烴核轉(zhuǎn)位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）二聚化，誘導(dǎo)免疫抑制性IL-10的表達，導(dǎo)致未成熟的CD4+T細胞向免疫抑制的Treg轉(zhuǎn)化[29]。

除上述3種機制外，研究表明Kyn下游的活性代謝物，如犬尿胺、3-羥基犬尿氨酸、鄰氨基苯甲酸、犬尿烯酸、喹啉酸等也具有免疫調(diào)節(jié)作用，在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞周期阻滯或凋亡[23-24]。這些機制共同建立了支持腫瘤生長的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。

圖2 IDO1在腫瘤免疫逃逸中的作用機制Figure 2 Mechanisms of action of IDO1 in tumor immune escape

2 IDO1抑制劑的研究現(xiàn)狀

鑒于IDO1在腫瘤免疫逃逸中的關(guān)鍵作用，IDO1抑制劑的研究備受各個科研機構(gòu)和制藥公司的青睞，但迄今為止尚無IDO1抑制劑獲得FDA批準上市。目前雖有多個IDO1抑制劑處于臨床研究的不同階段，但令人遺憾的是，進展最快的IDO1抑制劑epacadostat聯(lián)合PD-1單抗pembrolizumab治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的Ⅲ期臨床試驗（ECHO-301/Keynote-252）最終以失敗告終。這次臨床失敗給開發(fā)IDO1抑制劑的公司帶來了沉痛的打擊，但這僅是眾多臨床試驗中的一項，其失敗并不能斷定靶點IDO1不具有成藥性，究竟是IDO1本身靶點的問題還是化合物的問題目前尚未可知。下面首先歸納總結(jié)導(dǎo)致此次Ⅲ期臨床試驗失敗的可能的原因以及當(dāng)前開發(fā)IDO1抑制劑所面臨的關(guān)鍵問題；其次對現(xiàn)階段進入臨床研究的IDO1抑制劑及具有良好發(fā)展前景的尚處于臨床前研究的化合物進行綜述。

2.1 ECHO-301/Keynote-252 Ⅲ期臨床試驗失敗原因分析及目前IDO1抑制劑研發(fā)中的挑戰(zhàn)

Epacadostat是一種競爭性IDO1選擇性抑制劑，其聯(lián)合pembrolizumab治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的Ⅲ期臨床試驗（ECHO-301/Keynote-252）在近期被中止。在為期14個月的中期隨訪中，epacadostat +pembrolizumab組與pembrolizumab +安慰劑組相比，未能明顯延長無進展生存期（4.7月vs 4.9月），二者對藥物的反應(yīng)率分別為34.2%和31.5%；治療相關(guān)不良事件的發(fā)生率分別為79.3 %和81.0 %，大于3級治療相關(guān)不良事件的發(fā)生率分別為21.8%和17.0%。最終得出結(jié)論，在對不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者中，epacadostat聯(lián)合pembrolizumab并未比單獨使用pembrolizumab帶來更大的臨床益處，這種組合的安全性與以前報道的研究結(jié)果一致[30]。這些陰性結(jié)果出乎意料，因為對多達14種不同實體瘤的臨床前研究和早期臨床試驗都顯示出了令人鼓舞的結(jié)果。對此失敗，科學(xué)界提出了很多解釋，主要包括Ⅲ期臨床試驗設(shè)計方案、IDO1的生物學(xué)機制、用藥劑量、聯(lián)合用藥方式以及化合物本身等方面的問題。

在試驗設(shè)計方案方面，此次Ⅲ期臨床試驗預(yù)選病人的生物指標考慮不充分：首先，IDO1抑制劑起效的關(guān)鍵機制是恢復(fù)效應(yīng)T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力，因此試驗結(jié)果與患者腫瘤微環(huán)境中浸潤性T細胞的基態(tài)水平密切相關(guān)，而此次Ⅲ期臨床試驗中并未考察患者的這一指標；其次，雖然PD-L1的表達為隨機分層因子，但在早期研究以及此次Ⅲ期臨床試驗中僅以病人PD-L1的表達狀態(tài)作為參考，而未考慮IDO1的表達情況，這導(dǎo)致所篩選的病人IDO1并未呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，對IDO1抑制劑并不敏感。值得注意的是，早期與后期階段臨床試驗的人群之間也存在潛在的差異：早期階段的試驗在美國進行，而后期的研究主要在澳大利亞、歐洲、亞洲、南美洲等地區(qū)開展[31]。可能由于種族差異而導(dǎo)致2次試驗的結(jié)果不同。此外，在黑色素瘤治療中，IDO1抑制劑并未表現(xiàn)出單獨用藥療效，因而未事先進行規(guī)模較小的隨機Ⅱ期試驗，僅基于不受控制的Ⅰ/Ⅱ期試驗的少量數(shù)據(jù)而啟動大型Ⅲ期臨床試驗本身就具有較大的風(fēng)險。

雖然目前IDO1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究取得了重要進展，但是IDO1在生理病理中的確切調(diào)控機制以及對腫瘤微環(huán)境等的影響尚需進一步的確證。因而，對IDO1生物學(xué)功能和機制理解的不夠深入或許是造成臨床失敗的另一個重要原因。其一，另外2種Trp代謝酶IDO2和TDO在腫瘤免疫逃逸中可能也扮演著很重要的角色。比如，敲除小鼠IDO1后雖然延緩了4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移瘤的生長，但這種延緩是短暫的，隨后腫瘤繼續(xù)增長并伴隨著Kyn濃度的增加[32]。這表明選擇性阻斷IDO1的表達不足以持續(xù)緩解Trp減少和Kyn升高而引起的腫瘤免疫抑制效應(yīng)。這可能是由于IDO1酶活性被抑制后，TDO和IDO2通路發(fā)揮潛在的代償作用，造成Trp耗竭。其二，IDO1的非酶促作用可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，而目前開發(fā)的IDO1抑制劑主要靶向酶活性[7]。其三，Kyn是腫瘤內(nèi)Trp代謝后最穩(wěn)定的產(chǎn)物，被證明是AhR的內(nèi)源性配體。IDO1酶活性被抑制后腫瘤細胞可能還存在低水平的Kyn，而研究表明極低水平的Kyn足以激活A(yù)hR并且可以誘導(dǎo)AhR靶基因的表達，從而導(dǎo)致效應(yīng)T細胞向Treg的轉(zhuǎn)化[33-34]。因此，選擇性抑制IDO1酶活性是否足以解除Trp耗竭所造成的腫瘤免疫抑制目前還有待進一步確定。

實驗表明，epacadostat在100 mg（bid）給藥劑量下外周血漿Kyn水平達到最低水平，繼續(xù)增加劑量，Kyn水平不再繼續(xù)降低，故Ⅲ期試驗以Kyn在血清中的測量值為參考，選擇了該劑量進行試驗。眾所周知，P-糖蛋白（p-glycoprotein，P-gp）是一種常見的表達于細胞膜的保護細胞免受外來侵害的“分子泵”。其在黑色素瘤等腫瘤細胞中均有表達，而epacadostat是P-gp的底物，因此藥物會被當(dāng)作外來異物而不能完全被腫瘤細胞吸收。在此情況下，血藥濃度不能真實地反映瘤內(nèi)藥物濃度（即瘤內(nèi)藥物濃度低于血藥濃度），血清的Kyn水平自然也不能真實地反映腫瘤內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)下Kyn水平。綜上，Ⅲ期試驗中患者體內(nèi)是否給予足夠劑量的epacadostat存在不確定性。

Pembrolizumab與epacadostat聯(lián)合用藥可能未產(chǎn)生協(xié)同增效作用，原因可能是pembrolizumab單獨治療晚期黑色素瘤時已展現(xiàn)出良好的治療效果，而這種效果可能足以覆蓋epacadostat在聯(lián)合用藥中發(fā)揮的作用。不過也可能是由于IDO1抑制劑與抗PD-L1藥物聯(lián)合用藥本身就不能產(chǎn)生良好的協(xié)同作用。鑒于IDO1廣泛參與腫瘤免疫逃逸，IDO1抑制劑聯(lián)用其他免疫檢查點抑制劑值得嘗試和期待。比如，CTLA-4是另一種調(diào)節(jié)T細胞活性的免疫檢查點，目前CTLA-4抑制劑與IDO1抑制劑的聯(lián)用處于Ⅰ/Ⅱ期臨床研究階段。另外，目前已有IDO1/ PD-L1/CTLA-4多重免疫檢查點抑制劑聯(lián)用的報道[35]。

值得一提的是，Ⅲ期臨床試驗中所用的IDO1抑制劑epacadostat本身可能存在藥效活性不夠強、藥動學(xué)性質(zhì)不佳等問題，因此活性優(yōu)良、毒副作用少、具有良好藥動學(xué)性質(zhì)的新型IDO1抑制劑的研發(fā)迫在眉睫。然而，目前IDO1抑制劑的研發(fā)過程中還面臨許多挑戰(zhàn)。在體內(nèi)藥效學(xué)指標測試方面，臨床前及臨床試驗中瘤內(nèi)Kyn含量無法準確測定，L-Trp底物抑制情況以及抑制劑動力學(xué)測定等方面還需進一步優(yōu)化。在化合物發(fā)現(xiàn)方面，盡管IDO1蛋白與其抑制劑復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計提供了基礎(chǔ)，但由于IDO1蛋白結(jié)合口袋存在誘導(dǎo)契合現(xiàn)象，尤其是結(jié)合口袋B靈活多變，隨著抑制劑形狀和體積的改變，結(jié)合口袋自身的形狀和體積會有較大的改變。這種誘導(dǎo)契合的存在，一方面因可以容納多種不同形狀和體積的結(jié)構(gòu)而為結(jié)構(gòu)多樣的小分子抑制劑的設(shè)計帶來機遇，同時由于無法通過計算準確預(yù)測所設(shè)計化合物的活性也為獲得高活性 IDO1小分子抑制劑帶來極大的挑戰(zhàn)。另外，IDO1蛋白的催化活性位點中存在血紅素鐵，它可以通過形成共價鍵與配體相互作用，IDO1抑制劑與血紅素鐵結(jié)合部分的電子性質(zhì)對活性影響很大，但是這種影響在任何計算方法中都難以可靠地描述。

2.2 IDO1抑制劑

目前報道的IDO1抑制劑主要是通過高通量篩選、天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改造及基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計等途徑獲得。表1總結(jié)了目前進入臨床研究階段的IDO1抑制劑。下面將按結(jié)構(gòu)分類，重點討論這些進入臨床研究階段的IDO1抑制劑以及近期報道的結(jié)構(gòu)新穎且臨床前活性數(shù)據(jù)較好的IDO1抑制劑，以期對IDO1抑制劑的后續(xù)研究與開發(fā)提供依據(jù)。

表1 進入臨床研究的IDO1抑制劑Table 1 IDO1 inhibitors in clinical trials

2.2.1 色氨酸類似物 Trp類似物的設(shè)計旨在開發(fā)IDO1的競爭性抑制劑，在Trp的N-1原子上引入甲基得到外消旋體化合物1（1-MT）。該化合物是較弱的 IDO1 抑制劑（IC50= 34 μmol·L-1），目前更多的是作為臨床前研究IDO1通路的一種工具化合物。在HER-2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)基因模型中，1-MT單獨用藥對腫瘤生長幾乎沒有抑制作用，但可以增強多種化療藥物的療效，尤其是致DNA損傷藥物和紫杉醇，促進惡性腫瘤的消退[25]。后續(xù)將1-MT進行手性拆分得到D-1MT（現(xiàn)稱為indoximod，2）和L-1MT，D-1MT對IDO1酶幾乎無抑制活性，但在動物模型中，與L-1MT 相比，D-1MT表現(xiàn)出更強的抗腫瘤活性，目前D-1MT已成為具有潛在獨特療效的候選藥物[36]。后續(xù)的機制研究表明indoximod不是IDO1通路的直接抑制劑，對血漿Kyn的水平無影響，現(xiàn)在普遍認為其作用機制可能是調(diào)節(jié)Trp跨膜運輸[37]或模擬Trp調(diào)控IDO1下游信號通路[38]。Indoximod可能作為一種高親和力的Trp類似物，恢復(fù)T細胞因Trp減少而引起的mTORC1抑制，阻礙T細胞自噬，上調(diào)效應(yīng)T細胞中共調(diào)節(jié)受體可誘導(dǎo)共刺激分 子（inducible costimulatory molecule，ICOS） 的水平，從而提高細胞免疫功能[38]。Indoximod獨特的作用機制為Trp代謝相關(guān)的免疫治療藥物的開發(fā)提供了新的思路。鑒于indoximod可以緩解Trp減少引起的mTORC1信號分子的抑制，可以推斷其可以抑制任何Trp代謝酶高表達的腫瘤細胞的生長。Indoximod的Ⅰ期臨床研究表明其耐受性良好，最大給藥劑量為1 200 mg（bid）。在一項Ⅱ期試驗中，indoximod與PD-1單抗pembrolizumab聯(lián)用對某些晚期黑色素瘤患者的總體反應(yīng)率可達52%，與FDA批準的PD-1單抗nivolumab/CTLA-4單抗ipilimumab聯(lián)用的效果相當(dāng)，且未出現(xiàn)高度自身免疫反應(yīng)，因而其有望成為IDO1與其他藥物聯(lián)合用藥發(fā)展中的一個重要里程碑[39]。在另一項Ⅱ期臨床試驗中，indoximod聯(lián)用DC疫苗Provenge使得轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌病人的生存期相對于對照組延長了2倍之多[40]。目前，indoximod聯(lián)合pembrolizumab或nivolumab用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗正在進行中。為改善indoximod的藥動學(xué)性質(zhì)，NewLink公司開發(fā)了其前藥NLG-802，目前該化合物已進入Ⅰ期臨床試驗[41]。

Crosignani等[42]通過高通量篩選從178 000個化合物的化合物庫中得到了一些苗頭化合物，其中最具優(yōu)化潛力的是化合物3，盡管該化合物對人體IDO1酶僅顯示出中等的抑制效果（IC50=3.0 μmol·L-1），但其對人體 TDO 的 IC50高達 50 μmol·L-1，顯示其對IDO1具有較高的選擇性；并且由于該化合物相對分子質(zhì)量較低，配體效率（ligand eきciency，LE）較高（0.47），因而該化合物與人體IDO1具有高效的相互作用，這種作用遠高于其他含吲哚環(huán)的IDO1抑制劑。接著，Crosignani等[42]以化合物3為先導(dǎo)化合物，對此類化合物進行了深入的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系（structure-activiy relationship，SAR）研究：1）將琥珀酰亞胺結(jié)構(gòu)移除1或2個羰基得到吡咯烷酮類、吡咯烷，或擴環(huán)成戊二酰亞胺（或其位置異構(gòu)體）均會使活性大大降低；2）琥珀酰亞胺結(jié)構(gòu)的N原子或脂肪碳原子上引入甲基，或?qū)⑵浣Y(jié)構(gòu)中的CH2替換成NH或O，或在吲哚環(huán)和琥珀酰亞胺之間插入亞甲基均會大大降低其活性；3）將吲哚環(huán)替換成其他雜環(huán)時，活性均有所下降；4）在吲哚環(huán)的NH和C2、C4、C7位上分別引入取代基均使活性下降，而在吲哚環(huán)C5和C6位上引入某些取代基可以提高活性，如在C5位上引入氟、氯、溴時活性增加（IC50分別為0.15、0.83 和 0.37 μmol·L-1），而引入甲基、三氟甲氧基、三氟甲基時活性完全喪失，在C6位上引入溴活性提高（IC50= 0.42 μmol·L-1），但在 C5和 C6位分別引入氟和溴時活性卻不如僅在C5位引入氟得到的化合物4（PF-06840003）活性好（IC50= 0.15 μmol·L-1）。該化合物作為非競爭性IDO1抑制劑由iTeos SA公司授權(quán)給輝瑞公司。進一步對化合物4進行手性拆分，發(fā)現(xiàn)主要是R構(gòu)型的化合物5發(fā)揮作用（IDO1：IC50= 0.12 μmol·L-1），但在 HeLa 細胞體系中的酶抑制活性，2種構(gòu)型之間的活性差異僅為13倍，這可能是由于與羰基相鄰的手性碳的快速差向異構(gòu)化作用。因此，鑒于2種構(gòu)型在細胞水平上活性差異不大，后續(xù)研究用的藥物采用外消旋體。

為了進一步研究化合物4與IDO1的結(jié)合模式，Crosignani等[42]進一步解析了化合物4與IDO1的共晶結(jié)構(gòu)（見圖3）。由該圖可見，與其他IDO1抑制劑不同的是，該化合物不與血紅蛋白的鐵離子發(fā)生相互作用；Tyr126、Phe163、Phe164與吲哚環(huán)產(chǎn)生π-π相互作用，Leu234、Val130、Cys129殘基也可與吲哚環(huán)發(fā)生疏水相互作用，這些殘基共同組成了結(jié)合口袋A，圍繞在吲哚環(huán)周圍；吲哚環(huán)上的NH與Ser167形成氫鍵。琥珀酰亞胺環(huán)與亞鐵血紅素蛋白平面平行，其NH與血紅素蛋白上的7-羧酸形成氫鍵；2個羰基分別與Ala264 和Thr379的氨基形成氫鍵。IDO1酶的活性位點與化合物4堆積緊密，因而在吲哚環(huán)上引入較大基團，或者改造琥珀酰亞胺結(jié)構(gòu)均有可能造成活性的降低[42-43]。

圖3 IDO1/化合物4復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu) (PDB code: 5WHR)Figure 3 Crystal structure of IDO1 in complex with compound 4 (PDB code: 5WHR)

PF-06840003在體外能夠逆轉(zhuǎn)IDO1高表達導(dǎo)致的T細胞效能下降，并在體內(nèi)將腫瘤內(nèi)Kyn水平降低80%以上。該化合物具有較好的藥動學(xué)性質(zhì)，半衰期（16～19 h）較長，可允許每日單劑量給藥。此外，該化合物可以透過血腦屏障，因而可用于治療腦內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤[44]。目前，其用于治療惡性膠質(zhì)瘤已進入Ⅰ期臨床研究（NCT02764151）[25]。

此外，文獻和專利中還報道了Trp類似物IDO1抑制劑，如在吲哚環(huán)上引入一些可以伸入口袋B 的取代基得到化合物 6（IC50= 13.1 μmol · L-1）[44]、7（IC50= 46 μmol · L-1）[45]、8（IC50= 0.19 μmol · L-1）[46]、9（IC50= 7 μmol · L-1）[47]和 10（Ki= 11.5 μmol · L-1）[48]；將吲哚環(huán)替換成其他骨架得到一系列具有新穎結(jié)構(gòu)的化合物，如化合物11～13（IC50分別為5.3、6.1和 2.8 μmol·L-1）[49-51]，當(dāng)吲哚環(huán)被替換成吡啶并咪唑結(jié)構(gòu)時得到化合物 14（IC50＜ 1 μmol·L-1）[52]和15（IC50= 11 nmol·L-1）[53]，或以異 唑代替吲哚環(huán)得到化合物 16（IC50＜ 1 μmol·L-1）[54]。

2.2.2 芳基咪唑類及其衍生物 4-苯基咪唑（4-PI）（17）是1989年發(fā)現(xiàn)的一種較弱的IDO1非競爭性抑制劑（IC50= 48 μmol·L-1）[55]。為進一步研究4-PI與IDO1的結(jié)合模式，Sugimoto等[55]于2006年報道了4-PI與IDO1的共晶結(jié)構(gòu)；由圖4可見，4-PI占據(jù)了由Phe163、Cys129、Ser167、Gly261和Gly262所形成的疏水結(jié)合口袋A，咪唑環(huán)中的氮原子則與血紅素中鐵離子形成配位鍵，活性位點入口以及結(jié)合口袋B被結(jié)晶緩沖分子N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸（CHES）所占據(jù)，其位置與4-PI非常接近，Gly261和Gly262與CHES分子中的乙基磺酸鏈發(fā)生相互作用，而氨基與血紅素7-丙酸形成離子對。

圖4 IDO1/4-PI復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu) (PDB code: 2D0T)Figure 4 Crystal structure of IDO1 in complex with 4-PI(PDB code: 2D0T)

基于4-PI與IDO1的共晶結(jié)構(gòu)，Kumar等[56]對4-PI骨架展開了深入的結(jié)構(gòu)修飾（見圖5），主要包括：1）調(diào)節(jié)活性位點區(qū)域入口處的相互作用；2）調(diào)節(jié)內(nèi)部活性位點的作用，特別是與Cys129和Ser167的相互作用；3）調(diào)節(jié)與血紅素鐵離子的結(jié)合作用。調(diào)節(jié)活性位點入口處的相互作用，主要是在C1、N1和N3位進行結(jié)構(gòu)修飾。為模擬CHES分子中氨基部分與血紅素鐵離子的相互作用，該研究團隊在N1位引入取代基，使得活性完全喪失，而在N3位以芐基取代的化合物18意外有了與4-PI相當(dāng)?shù)幕钚裕↖C50= 32 μmol·L-1），這可能是該化合物的空間構(gòu)型能較好占據(jù)CHES緩沖分子所處的活性位點入口所致；然后，他們對4-PI結(jié)構(gòu)中占據(jù)結(jié)合口袋A的苯環(huán)進行了結(jié)構(gòu)改造，以巰基間位和鄰位取代的化合物19和20活性有較大的提高（IC50均為7.6 μmol·L-1），而在苯環(huán)的鄰位以羥基取代所得的化合物21活性比4-PI增加了10倍（IC50= 4.8 μmol·L-1），在化合物21的羥基上再引入一個較大的基團得到了 IC50小于 1 μmol·L-1的化合物 22；最后，為了進一步增加化合物與血紅素鐵離子的結(jié)合力，他們以不同的芳香雜環(huán)如吡啶、噻唑、吡唑和呋喃替代咪唑環(huán)，得到的大部分化合物活性均不如4-PI，這說明噻唑、吡唑和呋喃與血紅素鐵離子的結(jié)合力均不如咪唑[56]。這也不足為奇，咪唑環(huán)是一種被廣泛認可的天然鐵離子配體，在鐵離子結(jié)合強度和蛋白形狀互補性方面都是最佳的，例如含咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的組氨酸。但隨后的研究發(fā)現(xiàn)三氮唑類結(jié)構(gòu)也具有較好的活性，如化合物23（IC50=0.33 μmol·L-1）[57]。Tojo 等[58]基于合理藥物設(shè)計，將咪唑環(huán)替換成三氮唑并噻唑結(jié)構(gòu)得到化合物24（Amg-1，IC50= 3 μmol·L-1），并解析了該化合物與IDO1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，其顯示了新穎的結(jié)合模式。如圖6A所示，化合物24不僅可與血紅素鐵離子及結(jié)合口袋A發(fā)生相互作用，也能與另外一個由關(guān)鍵氨基酸殘基Phe226和Arg231形成的結(jié)合口袋B相互作用[58]。將咪唑環(huán)替換成咪唑并噻唑得到化合物25，活性略有提高（IC50= 1.9 μmol·L-1）。通過分析化合物25與IDO1的共晶結(jié)構(gòu)（見圖6B）得知，受氨基酸殘基Phe226的影響，化合物25側(cè)鏈亞甲基大幅度彎曲，使其側(cè)鏈上的苯環(huán)與Phe226發(fā)生π-π相互作用，無法與Arg231殘基產(chǎn)生靜電相互作用。而當(dāng)引入剛性連接臂以限制其側(cè)鏈構(gòu)象，使得苯環(huán)上的氰基足以到達Arg231殘基周圍，得到能夠同時與Phe226和Arg231相互作用的化合物26，活性顯著提高（IC50= 77 nmol·L-1）。這進一步說明結(jié)合口袋B以及氨基酸殘基Phe226和Arg231對于IDO1抑制劑活性的發(fā)揮具有重要作用[58]。

將4-PI的3位與2'位通過稠環(huán)連接形成三環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，并引入側(cè)鏈得到化合物NLG 919（navoximod，27）及其類似物28，活性大大提高（IC50分別為 13 和 38 nmol·L-1）。與其他芳基咪唑類IDO1抑制劑相同，NLG 919是一種非競爭性抑制劑，且具有較好的口服生物利用度、藥動學(xué)性質(zhì)和較小的毒副作用[59]。小鼠經(jīng)口給藥時，其血漿Kyn水平降低約50%，并減輕IDO1誘導(dǎo)的T細胞抑制。在臨床前模型中，化合物27極大地增強了B16黑色素瘤對疫苗的免疫應(yīng)答，在疫苗接種后4 d內(nèi)將腫瘤大小減少約95%。另外，該化合物能夠提高抗PD-1藥物對EMT6乳腺癌的療效，增加CD8+T細胞/Treg比率，提高血漿IFN-γ水平，并活化瘤內(nèi)巨噬細胞和DC[60]。ⅠA期臨床試驗（NCT02048709）數(shù)據(jù)顯示，22位患者平均給藥3個周期，化合物NLG 919展現(xiàn)出了較好的安全性、藥動學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)[61]。目前，該化合物聯(lián)合抗PD-L1單抗atezolizumab用于治療實體瘤的ⅠB期臨床試驗（NCT02471846）正在開展中。

圖5 苯基咪唑類IDO1抑制劑的優(yōu)化過程Figure 5 Optimization of IDO1 inhibitors based on benzimidazole

圖6 IDO1與化合物24和25的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)Figure 6 Crystal structures of IDO1 in complex with compounds 24-25

2016年，Peng等[62]報道了化合物28與IDO1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（見圖7）。此共晶結(jié)構(gòu)與IDO1/4-PI共晶結(jié)構(gòu)相比具有較大差異。在IDO1/4-PI復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，4-PI僅占據(jù)結(jié)合口袋A，而且血紅素的7-丙酸側(cè)鏈遠離配位點，并不與4-PI發(fā)生相互作用。因而4-PI更像是具有較弱IDO1抑制活性的片段樣化合物。而在IDO1/化合物28共晶結(jié)構(gòu)中，咪唑并異吲哚結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基Tyr126、Cys129、Val130、Phe163、Phe164、Gly262 和Ala264形成的疏水性口袋A發(fā)生疏水相互作用；1-環(huán)己基乙醇結(jié)構(gòu)則伸入另一個由氨基酸殘基Phe226、Ile354和Leu384形成的結(jié)合口袋B，并且與Arg231靠近發(fā)生靜電相互作用；咪唑的N1與血紅素鐵離子形成配位鍵。化合物28也可與IDO1蛋白形成廣泛的氫鍵網(wǎng)，如血紅蛋白7-丙酸分別與化合物28的羥基以及Ala264的NH形成分子間氫鍵；異吲哚上的氮原子與化合物28分子上的羥基形成分子內(nèi)氫鍵。與4-PI相比，化合物28能夠以更大的區(qū)域與IDO1蛋白相結(jié)合，并在空間上與IDO1形成廣泛的氫鍵網(wǎng)，這可能是化合物28比4-PI具有更好抑制活性的原因[62]。

圖7 IDO1/化合物28復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu) (PDB code: 5EK3)Figure 7 Crystal structure of IDO1 in complex with compound 28 (PDB code: 5EK3)

除了上述化合物外，目前專利中報道的芳基咪唑類IDO1抑制劑主要是針對NLG 919深入口袋B的側(cè)鏈的修飾以及對咪唑并異吲哚結(jié)構(gòu)的修飾所得的化合物（29 ～ 40）。其中，對側(cè)鏈的修飾，如將NLG 919的環(huán)己基醇結(jié)構(gòu)替換為?；倪哙きh(huán)或?；牡s環(huán)丁烷得到化合物29和30，二者IC50均小于1 μmol·L-1[63]；或在環(huán)己基上增加C橋也可以得到 IC50小于 100 nmol·L-1的化合物 31和 32[64]；連接環(huán)己醇與咪唑并異吲哚的連接臂上的羥基可以被移除，或以1或2個氟取代，得到化合物33 ～35（IC50＜ 100 nmol·L-1）[65]；也可以將整個側(cè)鏈替換得到化合物 36（IC50= 5.1 nmol·L-1）[66]。對咪唑并異吲哚結(jié)構(gòu)的修飾，以吡啶環(huán)代替咪唑并異吲哚的苯環(huán)，得到化合物37和38[65]（IC50均小于100 nmol·L-1），以噻唑環(huán)取代苯環(huán)得到化合物39（具體構(gòu)型未公布）（IC50= 7.2 nmol·L-1）[67]。另外，在咪唑并異吲哚環(huán)中間的五元環(huán)上插入一些基團而擴環(huán)，如增加CH2基團得到化合物40[68]，也能維持較好的抑制活性（IC50= 49 nmol·L-1）。

2.2.3N-羥基脒類 INCB24360（epacadostat，41）是由Incyte公司研發(fā)的羥基脒類IDO1選擇性抑制劑。其發(fā)現(xiàn)過程如圖8所示，通過高通量篩選得到了具有微摩爾活性的苗頭化合物42，其具有低相對分子質(zhì)量（ ＜ 250）、良好配體效率（LE=0.49）、微摩爾細胞水平 IDO1 抑制活性（IC50=1 μmol·L-1）以及良好的人結(jié)直腸癌細胞Caco-2滲透性（3.9×10-5cm·s-1）等特點，為后續(xù)研究提供了良好的起點[69]。早期的SAR研究表明：以苯基取代芐基后所得到的化合物對IDO1抑制效果更好；在苯環(huán)的間位增加一些取代基，如間位鹵素和較小烷基時，化合物的細胞活性可增強（間位取代的活性由大到小依次為：溴，氯；甲基，乙基；異丙基，氟；甲氧基，叔丁基）。在鄰位取代的基礎(chǔ)上，對位引入氟原子得到化合物43，其人體外血漿清除率有所增加，但細胞活性并不損失。該化合物具有較好的血漿清除率，可能是其相對分子質(zhì)量較低且含有2個分子內(nèi)氫鍵的低能構(gòu)象所致。將羥基脒結(jié)構(gòu)上的羥基替換成甲氧基，或?qū)⒘u胺的氮原子替換成硫或氧原子均會導(dǎo)致活性的降低或消失。化合物43在IDO1生化和細胞水平測試中表現(xiàn)出納摩爾級抑制活性（IC50=67 nmol·L-1），并且對TDO具有優(yōu)異的選擇性，但口服生物利用度差[69]。羥基脒的羥基在體內(nèi)發(fā)生葡萄糖醛酸化可能是羥基脒類化合物的主要代謝途徑，是造成此類化合物口服生物利用度差的主要原因。進一步的研究表明，呋咱環(huán)為維持活性所必需的基團。將呋咱環(huán)的側(cè)鏈位置增加一些取代基，通過空間或電子碰撞破壞化合物與近端葡糖醛酸糖苷酶活性位點的結(jié)合，可減少羥基脒發(fā)生葡萄糖醛酸化[70]。當(dāng)側(cè)鏈引入單取代烷基（如甲基、芐基等）時，IDO1抑制活性保留或稍有下降，但體外血漿清除率并未下降，這可能是由于這些化合物的疏水性而導(dǎo)致的蛋白結(jié)合率高所致。為了減少蛋白質(zhì)結(jié)合并恢復(fù)細胞活性，Incyte公司將呋咱環(huán)側(cè)鏈位置的氨基乙基取代基中加入多種極性基團形成一系列極性側(cè)鏈，以降低葡萄糖醛酸化的同時保持IDO1抑制活性，經(jīng)過一系列SAR研究后最終發(fā)現(xiàn)了一種高效的選擇性 IDO1 抑制劑 41（IC50= 72 nmol·L-1）[70]。

圖8 Epacadostat的優(yōu)化過程Figure 8 Optimization of epacadostat

Epacadostat作為人體IDO1的Trp競爭性抑制劑，對IDO2和TDO2具有100余倍的選擇性。在具有DC或腫瘤細胞的人類同種異體淋巴細胞的共培養(yǎng)物中，epacadostat促進效應(yīng)T細胞和NK細胞的生長，減少了T細胞向Treg的轉(zhuǎn)化，并增加了CD86+DC的數(shù)量[71]。在黑色素瘤的嚙齒類動物模型中，epacadostat能夠有效抑制腫瘤的生長，并且在新藥臨床研究（investigational new drug，IND）毒理學(xué)數(shù)據(jù)展現(xiàn)出良好的耐受性。另外，在B16黑色素瘤模型中，epacadostat顯著提高IL-2水平，促進CD8+T細胞增殖，增強CTLA4或PD-L1單抗的抗腫瘤作用[72]。在前期的臨床試驗中，epacadostat也顯示了良好的療效，但如前所述，epacadostat +pembrolizumab聯(lián)用治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的Ⅲ期臨床試驗（ECHO-301/Keynote-252）最終以失敗告終。

目前，epacadostat與IDO1的共晶結(jié)構(gòu)已被報道（見圖9）[73]。與其他IDO1抑制劑不同，epacadostat通過羥基脒上的氧原子與血紅素的鐵離子發(fā)生配位（其他IDO1抑制劑一般是通過氮原子），Ala264的NH與肟上的氧原子所形成的氫鍵可以穩(wěn)定此配位作用。該化合物內(nèi)存在2個分子內(nèi)氫鍵，包括肟上的氧與苯環(huán)上的NH以及肟上的氮與呋咱環(huán)上的NH形成的分子內(nèi)氫鍵，這種分子內(nèi)氫鍵使得epacadostat的構(gòu)型保持穩(wěn)定。苯環(huán)占據(jù)結(jié)合口袋A，與周圍氨基酸殘基Phe163、Leu234、Phe164、Val130、Tyr126和Ser167發(fā)生疏水作用，苯環(huán)上的氟原子靠近氨基酸殘基Cys129而發(fā)生氟-硫鍵的相互作用以穩(wěn)固蛋白與抑制劑的相互作用。呋咱環(huán)及極性側(cè)鏈伸入口袋B，與氨基酸殘基Phe163、Leu234和Phe226發(fā)生疏水相互作用，磺酰胺基團的氧原子與Arg231發(fā)生氫鍵相互作用[73]。

目前，基于epacadostat的結(jié)構(gòu)改造大多是對伸入口袋B的呋咱環(huán)和氨基側(cè)鏈進行修飾。如保留呋咱環(huán)結(jié)構(gòu)，改變側(cè)鏈得到化合物44～48[74-78]，其IC50分別為 18、11、33、26和 13 nmol·L-1；以其他芳環(huán)代替呋咱環(huán)得到化合物49（IC50= 111 nmol·L-1）和 50（IC50= 247 nmol·L-1）[79]；以環(huán)烷烴或雜環(huán)烷烴取代呋咱環(huán)并引入羰基得到化合物51（IC50= 2 nmol·L-1）和 52（IC50= 4 nmol·L-1）[80]；以環(huán)烷基取代的烷基鏈代替呋咱環(huán)得到IC50小于1 μmol·L-1的化合物53[81]；以硝基取代的苯并呋咱環(huán)結(jié)構(gòu)代替呋咱環(huán)得到化合物 54（IC50= 59 nmol·L-1）[82]。

圖9 IDO1/epacadostat復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu) (PDB code: 5WN8)Figure 9 Crystal structure of IDO1/epacadostat complex (PDB code: 5WN8)

2.2.4 喹啉類及其他類化合物 BMS-986205（55）是BMS公司從Flexus公司收購的高效、可口服的IDO1抑制劑。它是目前進入臨床研究的唯一一種自殺型抑制劑（不可逆抑制劑）。在臨床前試驗中，BMS-986205對HEK293細胞及HeLa細胞的IDO1酶抑制活性（IC50）分別達到1.1和1.7 nmol·L-1。在BMS-986205存在下，與人癌細胞共培養(yǎng)的T細胞能夠大幅增殖。在同系和異種移植小鼠模型中，該化合物顯示出優(yōu)于navoximod（27）和epacadostat（41）的藥效學(xué)性質(zhì)。評估對比治療前和治療中腫瘤組織樣本，BMS-986205使腫瘤內(nèi)Kyn水平降低90%[33]。然而受 ECHO-301/Keynote-252的影響，BMS-986205與PD-1單抗nivolumab聯(lián)用的Ⅲ期臨床試驗被終止。Flexus公司基于化合物55得到一系列其他喹啉類化合物（56 ～ 62）[83-84]。構(gòu)效關(guān)系表明：環(huán)己烷很重要，將其替換成環(huán)戊烷、環(huán)丁烷均會導(dǎo)致活性的降低，但以4-羥基哌啶或4-羥基環(huán)己烷替代環(huán)己烷得到的化合物56和 57活性保持（IC50均小于50 nmol·L-1）；環(huán)己基與苯環(huán)間的酰胺鍵替換成反轉(zhuǎn)后的酰胺鍵、磺酰胺鍵或脲基，活性保持，如化合物 58 ～ 60（IC50均小于 50 nmol·L-1）；喹啉環(huán)替換成單芳環(huán)得到的化合物61活性保持（IC50＜100 nmol·L-1）。

苯環(huán)上以氰基取代得到化合物BMS-116（62，IC50＜ 100 nmol·L-1），該化合物與 IDO1 形成的共晶結(jié)構(gòu)在近期被報道（見圖10A）[85]。與經(jīng)典的IDO1抑制劑不同，化合物62是通過與不含亞鐵血紅素的IDO1結(jié)合而發(fā)揮作用。其中氰基取代的苯環(huán)占據(jù) 由 Leu234、Gly262、Ser263、Ala264、Phe163、Phe164、Val130、Cys129和Tyr126等氨基酸殘基形成的結(jié)合口袋A，與Tyr126殘基發(fā)生π-π相互作用。酰胺基團上的NH與周圍的Ser167發(fā)生氫鍵相互作用。環(huán)己基起到連接鏈的作用，使喹啉環(huán)正好處于由Phe270、Phe214、His346和Arg343形成的疏水性口袋中，其中喹啉環(huán)可與Phe270發(fā)生π-π相互作用；喹啉環(huán)上的N可與Arg343形成氫鍵[85]。值得一提的是，這種疏水口袋與以往報道的口袋A和口袋B不同，是一種新發(fā)現(xiàn)的抑制劑結(jié)合位點，與Lewis-Ballester等[73]在2017年報道的IDO1-CNTrp/3-吲哚乙醇（63，3-indole ethanol，IDE）復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（見圖10 B）中的第2個色氨酸結(jié)合位點（Si）相對應(yīng)。早期研究表明：當(dāng)Trp大量存在時，Trp會占據(jù)Si位點，改變酶的構(gòu)型，使IDO1酶出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致酶的催化反應(yīng)速率降低。IDE作為IDO1酶的效應(yīng)分子通過占據(jù)Si位點來提高IDO1酶的活性[86]。從圖10B中可以看出，IDE分子緊鄰血紅蛋白分子，吲哚環(huán)與血紅蛋白平行，IDE分子上的羥基與血紅蛋白的6-丙酸形成氫鍵。吲哚環(huán)進入由Phe270、Val170、Ala174、Phe273、Ala210、Leu207、Leu339、Leu342和Phe244組成的疏水性口袋[73]。這種獨特的結(jié)合模式表明除了經(jīng)典的活性位點（口袋A與口袋B）對底物活化至關(guān)重要，另一結(jié)合位點Si也能在酶與底物的結(jié)合中發(fā)揮重要作用。Si位點為高濃度Trp條件下出現(xiàn)的底物抑制現(xiàn)象提供了合理解釋，也為變構(gòu)抑制劑的開發(fā)提供了新的靶點。

Pham等[87]近期報道了BMS-986205與IDO1結(jié)合的3種共晶結(jié)構(gòu)，每種共晶結(jié)構(gòu)均含有2個不同的單體，從而確定了該抑制劑與蛋白結(jié)合的動力學(xué)途徑。BMS-986205首先在活性位點附近的溶劑表面裂縫中以延伸的構(gòu)象與蛋白結(jié)合，此時抑制劑構(gòu)象如圖11A中構(gòu)象1（conformation 1，C1）[87]。緊接著，結(jié)合部位活性位點部分打開，觸發(fā)血紅素釋放，從而暴露出新的結(jié)合口袋。然后，抑制劑經(jīng)歷大范圍運動到達這個新的結(jié)合口袋，并以高能量扭曲構(gòu)象與蛋白結(jié)合（C2）。C2構(gòu)象并不穩(wěn)定，抑制劑通過構(gòu)象的轉(zhuǎn)變使抑制劑松弛至彎曲的構(gòu)象（C3），達到能量最小的穩(wěn)定狀態(tài)。這種抑制劑的穩(wěn)定構(gòu)型的晶體結(jié)構(gòu)與BMS-116的晶體結(jié)構(gòu)類似，此構(gòu)型的抑制劑與不含血紅蛋白的IDO1酶相互作用，且只占據(jù)活性位點的口袋A及Si位點。氯取代的苯環(huán)占據(jù)結(jié)合口袋A，環(huán)己基使喹啉環(huán)導(dǎo)向Si位點。在Si位點，Phe270與喹啉環(huán)發(fā)生π-π相互作用，喹啉環(huán)的N原子與Arg343產(chǎn)生氫鍵相互作用；酰胺鍵上的N和O分別與Ser167和His346產(chǎn)生氫鍵相互作用[87]。BMS-986205進入最終結(jié)合位點的動力學(xué)路徑突出表現(xiàn)了IDO1蛋白質(zhì)超強的可塑性及該抑制劑獨特的靈活性。由于目前對蛋白的結(jié)構(gòu)信息的了解有限，藥物的研發(fā)受到阻礙。因而研究人員需要更深入地了解更多的抑制劑的特定晶體結(jié)構(gòu)的不同特征，了解靶標活性位點內(nèi)的配體-IDO1之間的相互作用，這才有助于設(shè)計新型的強效和選擇性IDO1抑制劑。

圖 10 IDO1與BMS-116和IDE的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)Figure 10 Crystal structures of IDO1 in complex with BMS-116 and IDE

圖11 IDO1與BMS-986205的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)Figure 11 Crystal structure of IDO1 in complex with BMS-986205

2.2.5 其他結(jié)構(gòu)類型的IDO1抑制劑 除上述幾類主要的抑制劑外，目前還有許多其他結(jié)構(gòu)新穎的IDO1抑制劑被報道。具有苯磺酰肼結(jié)構(gòu)的化合物64（IC50= 35.8 nmol·L-1），是一種高效的可口服的選擇性IDO1抑制劑[88]，在小鼠CT26同系模型中，經(jīng)口給予400 mg·kg-1后顯示出59%的口服生物利用度和73%的抑瘤率。具有嘧啶酮結(jié)構(gòu)的化合物 65（IC50= 7.5 μmol·L-1），由于其良好的細胞穿透性以及低毒性，使得此類骨架的化合物值得進一步被研究[5]。通過高通量虛擬篩選方法以及IDO1體外生物活性測試，獲得了結(jié)構(gòu)新穎且配體結(jié)合效率適中的化合物66 ～ 68（IC50分別為7.5、7.5 和 0.84 μmol·L-1）[89-90]，基于這些化合物進行結(jié)構(gòu)修飾有望獲得新型IDO1抑制劑。默沙東（Merck Sharp & Dohme）公司近期也報道了一類高效的IDO1 抑制劑，如化合物 69（IC50= 0.7 nmol·L-1）[91]。百時美施貴寶（BMS）公司報道的一系列含苯基脲結(jié)構(gòu)的化合物如70均具有較好的細胞活性（IC50=3 nmol·L-1）[92]。通過拼合手段得到的具有芳基取代的丙烯酸結(jié)構(gòu)的化合物71[93]，其IC50為2.5 μmol·L-1。芳基噻唑啉結(jié)構(gòu)中以化合物72活性最佳（IC50= 2.5 μmol·L-1），雖然對其苯環(huán)上的結(jié)構(gòu)修飾空間有限，但是此系列也存在改造結(jié)合口袋B的可能性[94]。近期，一些醌類化合物如73被看作是高效且低毒的 IDO1 抑制劑（IC50= 23 nmol·L-1）[95]，但醌類化合物的作用機制可能仍需進一步探討。

3 結(jié)語與展望

近年來，腫瘤免疫療法已經(jīng)取得了突破性進展，為人類戰(zhàn)勝惡性腫瘤帶來了希望的曙光。IDO1在腫瘤細胞以及多種免疫細胞中高表達，催化Trp的Kyn代謝途徑中的關(guān)鍵步驟，造成腫瘤微環(huán)境中Trp耗竭，通過調(diào)控GCN2、mTOR和AhR等信號通路影響腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)T細胞和免疫抑制性Treg的增殖與活性，造成免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，使得腫瘤細胞逃脫機體免疫系統(tǒng)的攻擊。因此，IDO1成為小分子免疫檢查點抑制劑的潛在有效靶點，備受各大制藥公司和科研機構(gòu)的青睞。IDO1與其抑制劑共晶結(jié)構(gòu)不斷被報道，為基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，特別是最近發(fā)現(xiàn)的Si位點為IDO1變構(gòu)抑制劑的開發(fā)與研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，已報道了多種不同結(jié)構(gòu)類型的 IDO1小分子抑制劑，并且有多個抑制劑進入臨床研究階段。但是令人遺憾的是，最近報道的臨床試驗結(jié)果并不理想。特別是，進展最快的IDO1抑制劑epacadostat聯(lián)合PD-1單抗pembrolizumab治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的Ⅲ期臨床試驗（ECHO-301 / Keynote-252）以失敗告終。這次臨床試驗的失敗并不代表IDO1靶點不具有成藥性，但說明IDO1抑制劑的研發(fā)的確還存在很多亟待解決的問題。比如，在生物學(xué)機制方面，腫瘤細胞如何誘導(dǎo)自身 IDO1 高表達、IDO1對腫瘤微環(huán)境的影響及其確切的作用機制、Trp代謝通路及其下游代謝產(chǎn)物在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮的作用、IDO1與它的2種同工酶IDO2和TDO在腫瘤免疫逃逸中關(guān)聯(lián)與區(qū)別等關(guān)鍵問題目前尚不完全清楚。在抑制劑的設(shè)計方面，IDO1蛋白的結(jié)合口袋B靈活多變，為設(shè)計結(jié)構(gòu)多樣的IDO1抑制劑帶來機遇，但也為高活性IDO1抑制劑的設(shè)計帶來挑戰(zhàn)。在抑制劑活性測試方面，Kyn的瘤內(nèi)含量、L-Trp底物抑制情況以及抑制劑動力學(xué)測定等方面還需進一步優(yōu)化。盡管IDO1與PD-L1單抗聯(lián)用的臨床試驗失敗，但IDO1與其他免疫檢查點抑制劑聯(lián)用于其他腫瘤的治療仍值得期待，并且這可能是IDO1抑制劑未來的主要研究方向之一。隨著研究方法和技術(shù)的成熟，以及IDO1通路在腫瘤免疫逃逸中的作用機制被闡明，更多具有新結(jié)構(gòu)類型、新作用模式的高效