綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的尖孢鐮刀菌 在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖

呂桂云 郭紹貴 張海英 耿麗華 許勇

目的與意義：西瓜枯萎病是由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌寄生引起的一種真菌土傳病害，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)降低的最嚴(yán)重病害。明確枯萎病菌與寄主植物之間的互作機(jī)制，揭示其相互作用的分子機(jī)制，可為西瓜抗枯萎病育種和病害防治奠定理論基礎(chǔ)。利用綠色熒光蛋白（GFP）作為標(biāo)記，研究枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖動(dòng)態(tài)，從組織學(xué)的角度來(lái)闡釋西瓜與枯萎病菌親和互作和非親和互作的差異。

材料與方法：1.以農(nóng)桿菌AGL1為介導(dǎo)，將帶有潮霉素抗性基因pCH-sGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到西瓜枯萎病菌中，成功獲得了能穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白的枯萎病菌的突變株BEIJING1-sGFP，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抗性鑒定表明，組成型表達(dá)sGFP的BEIJING1- sGFP不影響枯萎病菌的致病力。2.以抗病品種‘PI 296341-FR（PI）與感病品種‘Black Diamond （BD）為試驗(yàn)材料，種子消毒后催芽，采用浸根法接種病菌。3.在接種后的 6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d 、8 d取樣進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

結(jié)果與分析：從西瓜枯萎病菌GFP轉(zhuǎn)化株中選出致病力與轉(zhuǎn)化前的野生型FON1在西瓜抗、感鑒別寄主上的表現(xiàn)無(wú)明顯差異菌株命名為BEIJING1- sGFP，繼代培養(yǎng)后的菌體都有穩(wěn)定而強(qiáng)的熒光信號(hào)，但在細(xì)胞質(zhì)中的液泡無(wú)熒光信號(hào)。通過(guò)人工接種，在無(wú)菌條件下進(jìn)行致病力的檢測(cè)，BEIJING1- sGFP與轉(zhuǎn)化前的野生型FON1在西瓜抗、感鑒別寄主上的表現(xiàn)無(wú)明顯差異，說(shuō)明GFP的轉(zhuǎn)化和表達(dá)對(duì)枯萎病菌的轉(zhuǎn)化株的致病力無(wú)明顯影響。

用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)GFP標(biāo)記的西瓜枯萎病菌侵染西瓜感病品種‘Black Diamond過(guò)程。在接種6 h后，僅有少量孢子開始萌發(fā)（<5%），孢子從一端伸出形成芽管;在1 dpi附著在根系表面的孢子大部分都已經(jīng)萌發(fā)，形成一個(gè)長(zhǎng)芽管，芽管可向各個(gè)方向生長(zhǎng)，菌絲在根表生長(zhǎng)，隨處可見(jiàn)。試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲主要出現(xiàn)在根毛區(qū)域，菌絲最初黏附在根毛上，然后到達(dá)根毛區(qū)的根系表面。在接種后2 d，菌絲已經(jīng)開始侵入了根部的表皮細(xì)胞。在滲透位點(diǎn)，呈現(xiàn)為比較重的綠色，菌絲形成類似附著胞的侵染結(jié)構(gòu)，有的菌絲可以形成多個(gè)這樣的侵入結(jié)構(gòu)，一些孢子在萌發(fā)后，很快就形成附著胞，也有的先在根系表面形成菌絲的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

接種后3～4 d，在幾個(gè)觀察點(diǎn)上，菌絲主要沿著根系的縱軸伸長(zhǎng)，或與根毛松松的交織在一起，到第4天根表已經(jīng)被相互交織的菌絲稀稀疏疏或稠密的包圍，菌絲已經(jīng)擴(kuò)展到了更大的面積，菌絲沿著表皮細(xì)胞的凹槽或者在細(xì)胞間隙間生長(zhǎng)，在細(xì)胞周邊形成一個(gè)綠色熒光框。在接種后5～6 d，在維管中發(fā)現(xiàn)了菌絲生長(zhǎng)，在維管周圍皮層細(xì)胞中的間隙也有大量的菌絲形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明菌絲已經(jīng)侵入了皮層細(xì)胞和維管束。在5 dpi，根系嚴(yán)重被感染，根表菌絲已形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，僅有根尖部位還保持沒(méi)有被感染，菌絲已經(jīng)到達(dá)了中柱螺紋維管處，并沿著木質(zhì)部生長(zhǎng)延伸。接種后第7天到第8天，一些最早定殖的菌絲開始產(chǎn)孢，形成分生孢子，分生孢子繼續(xù)萌發(fā)，形成再侵染;在根系三級(jí)和二級(jí)的側(cè)根上，菌絲網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)緊緊包圍了根系表面的大部分地方，并且侵染的范圍已經(jīng)擴(kuò)展到了根尖，在部分小的側(cè)根，菌絲完全定殖在根部組織中，并將其原有的結(jié)構(gòu)完全破壞，從顯微觀察看，根表完全被菌絲覆蓋，感染的根系組織已經(jīng)瓦解，菌絲充滿所有的組織空隙，并包圍根系的表面。

在抗病品種中，在接種后前3 d與感病品種沒(méi)有明顯差異，在第4～5天在抗病品種的根系表面形成的菌絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)沒(méi)有感病品種那么密集和明顯，在抗病品種只是形成零星的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，尤其是在主根上。在抗病品種也只能看到菌絲零星侵入到皮層細(xì)胞，抗病品種的侵染相對(duì)于感病品種是相對(duì)滯后的。菌絲形成的分生孢子沒(méi)有大量再萌發(fā)的跡象，菌絲也能侵入根尖區(qū)域。侵染的程度也相對(duì)較輕，抗病品種與感病品種沒(méi)有質(zhì)的區(qū)別，只是量的區(qū)別和時(shí)序上的差異。但在抗病品種中側(cè)根中，與感病品種差異不大，根表也形成稠密的菌絲網(wǎng)絡(luò)，菌絲能侵入皮層，根系的組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生瓦解。寄主產(chǎn)生某種物質(zhì)，規(guī)避病原菌侵染主根，或由側(cè)根的維管進(jìn)入主根的維管部位。此外，西瓜抗枯萎病不是抗侵入，而是抗擴(kuò)張，再次形成的孢子沒(méi)有大量萌發(fā)的跡象，而在感病品種中，形成的孢子，隨即萌發(fā)開始新的世代。

枯萎病菌能從自然開口處（如側(cè)生根發(fā)生處）和傷口處（如細(xì)胞壁破碎的表皮細(xì)胞和創(chuàng)傷處）侵染西瓜根系。通過(guò)PI染色，發(fā)現(xiàn)菌絲。侵入的細(xì)胞內(nèi)有霧狀的紅色，說(shuō)明此細(xì)胞壁已經(jīng)破碎，染料PI已經(jīng)滲入表皮細(xì)胞。在接種后3 d，菌絲就能通過(guò)傷口直接侵入維管組織，并迅速在維管內(nèi)延伸。菌絲可以在正常的根系表面，通過(guò)在侵入位點(diǎn)形成類似附著胞的侵入結(jié)構(gòu)，直接侵入表皮細(xì)胞。此結(jié)果驗(yàn)證枯萎病菌是通過(guò)自然開口如細(xì)胞之間的縫隙、表皮的凹陷部位和次生根毛的基部和傷口進(jìn)入植物的，但傷口也不是其侵染的必要條件，它也可以直接侵染。

結(jié)? ? 論：利用激光共聚焦顯微鏡觀察病原菌在西瓜根系的附著、侵染和定殖等過(guò)程。根系表面的孢子在接種當(dāng)天就開始萌發(fā)，菌絲沿著根系表面的縱軸方向伸長(zhǎng)，在內(nèi)部是沿著細(xì)胞間隙或細(xì)胞間的凹槽生長(zhǎng)，菌絲在接種后的第5天就能達(dá)到維管束，在侵染后期，產(chǎn)生的分生孢子能再次萌發(fā)，形成二次侵染和侵染的繼續(xù)擴(kuò)張，最后菌絲完全充滿根系組織，并伴隨根系組織的瓦解完成其定殖的過(guò)程。病原菌在抗、感品種的側(cè)根侵染中，基本無(wú)差異，但在抗病西瓜品種主根的侵染中與感病品種存在差異，再生的孢子不萌發(fā)，侵染過(guò)程滯后，侵染程度比較輕，說(shuō)明西瓜的抗病表現(xiàn)在抗定殖，而不是抗侵入。根系的自然開口和傷口是病原菌優(yōu)先侵染的位點(diǎn)，但不是枯萎病菌侵染根系所必須的，病菌可以通過(guò)形成類似附著胞的侵染結(jié)構(gòu)直接侵入根系表皮的細(xì)胞。