形態(tài)觀察、RNA-Seq定量和表達(dá)譜分析： 南瓜砧木嫁接西瓜類胡蘿卜素生物合成的新見解

劉 廣 羊杏平 徐錦華 張曼 侯茜 朱凌麗 黃瑩 熊愛生

目的與意義： 西瓜（Citrullus lanatus）屬于葫蘆科家族的一員，是一種重要的園藝作物，以其營養(yǎng)多汁的果肉聞名全世界。西瓜種植效益較高，但受枯萎病的影響，不能在同一園區(qū)實現(xiàn)連年栽培。嫁接技術(shù)的應(yīng)用有效地解決了西瓜不能連作的難題。為了充分發(fā)掘果實發(fā)育期南瓜砧木對嫁接西瓜基因表達(dá)的影響及鑒定參與嫁接西瓜番茄紅素生物合成的基因，本研究以自根西瓜、自根嫁接西瓜、南瓜嫁接西瓜果實四個發(fā)育時期的瓜瓤組織為試驗材料，利用HPLC測定番茄紅素的含量，并用RNA-Seq（quantification）技術(shù)及qRT-PCR進行了基因組范圍內(nèi)轉(zhuǎn)錄本的研究。

材料與方法：（1）采用RNAiso Plus（Takara，大連，中國）的試劑盒進行果肉組織樣本總RNA的提取。（2）使用RNA Pico芯片的安捷倫2100生物分析儀（美國）進行RNA濃度和質(zhì)量的評估。（3）構(gòu)建RNA-Seq文庫，通過Illumina公司HiSeq 2000測序平臺進行測序。（4）對這些文庫進行了RNA-Seq量化測序。使用SOAPaligner / SOAP2軟件（Li et al. 2009）對葫蘆科網(wǎng)站上已發(fā)表的西瓜參考基因序列進行比對。（5）使用NOIseq方法確定每個基因差異表達(dá)統(tǒng)計的顯著性（Sonia et al. 2011）。（6）使用高效液相色譜儀器分析番茄紅素，在472 nm UV-V光譜檢測。（7）選擇了8個與番茄紅素生物合成相關(guān)的差異表達(dá)基因進行qRT-PCR。實時PCR反應(yīng)條件是：95 ℃ 3 min，其次是95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40個循環(huán)。然后在60 ℃進行溶解曲線分析。

結(jié)果與分析： ①對自根西瓜（NGW）、自根嫁接西瓜（SGW）及南瓜嫁接西瓜（PGW）在果實發(fā)育時期的果實變化進行了研究。結(jié)果表明，在果形指數(shù)上，NGW、SGW、PGW之間各個時期差異不大，在成熟期時三者的果形指數(shù)均為1。在果實可溶性固形物含量方面，成熟時三者的中心可溶性固形物為13%左右，邊緣可溶性固形物約為9.8%，表明嫁接對果實的可溶性固形物含量無顯著影響。在單果質(zhì)量方面，NGW、SGW、PGW 4個時期差異不大，成熟期時三者約為5kg，南瓜砧木未顯著降低嫁接西瓜的單果質(zhì)量。在果肉硬度方面，除26DAP，其余時期PGW與NGW、SGW無顯著差異，南瓜砧木對嫁接西瓜果實的硬度無顯著影響。（2）采用高效液相色譜法測定NGW、SGW和PGW西瓜果實在四個不同發(fā)育階段番茄紅素的含量。研究結(jié)果顯示，嫁接西瓜中β-胡蘿卜素含量極低，在果肉中番茄紅素占主導(dǎo)地位。在NGW和SGW中，果實中果肉番茄紅素的含量在整個果實發(fā)育成熟期明顯增加，番茄紅素含量最高為約35 μg·g-1 FW。然而，在PGW中，果實番茄紅素含量在4個發(fā)育時期呈先增加后下降的趨勢，在26 DAP時，它達(dá)到了峰值，為27 μg·g-1 FW，然后略有下降，直到成熟期34 DAP時，為24 μg·g-1 FW。（3）在這項研究中，我們對編碼番茄紅素合成途徑的關(guān)鍵酶基因進行了分析。共有來自于8個與番茄紅素相關(guān)的基因家族的33個基因在果肉著色和植物營養(yǎng)價值中發(fā)揮巨大作用。筆者對這33個基因在果實發(fā)育成熟的四個時期的基因表達(dá)情況進行了追蹤。（4）在西瓜測序結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)與GGPS、CRTISO和CHYe酶合成相關(guān)的基因都只有1個，分別為WMU29546、WMU64670和WMU14036。2個基因WMU38667和WMU69109參與調(diào)控PSY酶，WMU41454和WMU66972參與調(diào)控ZDS酶，基因WMU41454和WMU66972參與調(diào)控LCYb。有3個基因WMU32086、WMU04959和WMU08893參與調(diào)控PDS合成。共有21個基因參與調(diào)控CRTISO。然后根據(jù)他們的表達(dá)模式，筆者進一步將這33個番茄紅素生物合成相關(guān)的差異表達(dá)基因分為4類：第一類為在果實發(fā)育四個時期都高度表達(dá)的差異基因;第二類為在果實發(fā)育后3個時期（18DAP，26DAP和34DAP）基因表達(dá)水平較高;第三類為在果實發(fā)育后兩個時期（26DAP和34DAP）基因表達(dá)水平較高;第四類為在果實發(fā)育四個時期都低度表達(dá)的差異基因。在NGW、SGW和PGW中，有28個基因表達(dá)一致。有5個基因在NGW、SGW和PGW果實發(fā)育期表現(xiàn)不一致，基因WMU69109在NGW和PGW歸為第二類，而在SGW表現(xiàn)為第一類;基因WMU22455在NGW和SGW中歸為第二類，而在PGW表現(xiàn)為第一類;基因WMU23214 、WMU71326和WMU30436在NGW和SGW歸為第三類，而在PGW表現(xiàn)為第二類。此外，PGW中發(fā)現(xiàn)有9個基因在果實發(fā)育期的變化趨勢與兩對照不一致，包括WMU66972、WMU79499、WMU71326、WMU42266、WMU64670、WMU36962、WMU71302、WMU75287和WMU14036基因。（5）結(jié)果顯示，挑選的8個基因在數(shù)字表達(dá)分析和qRT-PCR分析2種方法上雖然在不同時期的表達(dá)上數(shù)據(jù)存在一些差異，但是這些基因在果實發(fā)育時期的基因表達(dá)變化上趨勢大概一致。RNA-Seq和qRT-PCR在基因表達(dá)水平上具有很高的相關(guān)性（r2 = 0.61～0.97）。

結(jié)? ? 論： 轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)提供了果實發(fā)育期間嫁接誘導(dǎo)基因調(diào)控番茄紅素生物合成新的信息。8個基因家族（GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LCYb、LCYe和CHY）中33個基因的表達(dá)水平與番茄紅素的生物合成有關(guān)。南瓜嫁接西瓜果實發(fā)育過程中有14個基因差異表達(dá)，這表明這些基因可能有助于調(diào)控嫁接西瓜果實中番茄紅素的生物合成。