西瓜果實(shí)長(zhǎng)圓的遺傳及候選基因定位

豆峻嶺 趙勝杰 路緒強(qiáng) 何楠 張磊 匡漢暉 劉文革

目的與意義：果實(shí)形狀作為一個(gè)非常重要的農(nóng)藝性狀，在許多作物中已經(jīng)有了非常深入的研究，同時(shí)也獲得了許多控制果實(shí)形狀的候選基因。隨著2012年西瓜全基因組測(cè)序的完成，西瓜分子生物學(xué)的研究得到了快速發(fā)展，目前關(guān)于西瓜遺傳圖譜的報(bào)道有很多，根據(jù)遺傳圖譜也得到了許多性狀的QTLs，尤其是西瓜果實(shí)的長(zhǎng)度、寬度、果形指數(shù)等。然而目前還沒(méi)有關(guān)于西瓜果實(shí)形狀候選基因定位的報(bào)道。因此筆者通過(guò)配制雜交組合，解析西瓜果實(shí)形狀的遺傳模式，同時(shí)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，希望能夠獲得控制西瓜果實(shí)形狀的候選基因。

材料與方法：以長(zhǎng)果西瓜自交系‘短125（P1）和圓果西瓜自交系‘鄭州籽瓜（P2）為親本雜交配制F1，F(xiàn)1自交配制F2分離群體，F(xiàn)1分別和P1、P2回交配制回交群體BC1P1、BC1P2。采用BSA（混合群體分離分析）測(cè)序法從F2分離群體中分別選取長(zhǎng)瓜30株、圓瓜30株，分別采取葉片提取DNA，然后分別將長(zhǎng)瓜和圓瓜DNA等量混合，送公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序。結(jié)合GWAS（全基因組關(guān)聯(lián)分析）分析得到控制西瓜果實(shí)形狀的候選區(qū)間。之后通過(guò)分析候選區(qū)間內(nèi)的SNPs，開發(fā)出298個(gè)CAPS標(biāo)記，根據(jù)這些標(biāo)記對(duì)430株F2分離群體進(jìn)行酶切檢測(cè)，篩選重組單株，從而縮小候選區(qū)間。最終通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)候選基因在不同發(fā)育時(shí)期不同組織器官中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

結(jié)果與分析：（1）通過(guò)對(duì)西瓜果實(shí)形狀六世代群體的遺傳分析，西瓜果實(shí)長(zhǎng)圓為單基因不完全顯性遺傳，其中果實(shí)長(zhǎng)為顯性純合（OO），果實(shí)圓為隱性純合（oo），而果實(shí)橢圓為雜合（Oo）。同時(shí)對(duì)兩親本發(fā)育過(guò)程果形指數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，授粉當(dāng)天果形指數(shù)最大，長(zhǎng)瓜達(dá)到3.15，圓瓜達(dá)到1.43。而隨著果實(shí)的發(fā)育，長(zhǎng)瓜最終維持在1.83左右，而圓瓜維持在1.02左右。（2）通過(guò)BSA和GWAS相結(jié)合的方法，西瓜果實(shí)形狀被定位在3號(hào)染色體23.52～28.83 Mb的區(qū)間內(nèi)。進(jìn)一步通過(guò)CAPS標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位，最終候選基因被定位到3號(hào)染色體26.817～26.863 Mb的區(qū)間內(nèi)（原圖4）。比對(duì)參考基因組中該區(qū)間內(nèi)的功能基因，最終發(fā)現(xiàn)在該區(qū)間只有4個(gè)功能基因，分別擴(kuò)增這4個(gè)基因，最終發(fā)現(xiàn)Cla011257在長(zhǎng)瓜中有1個(gè)159 bp缺失，而該缺失造成了53個(gè)氨基酸缺失。繼續(xù)比對(duì)2個(gè)參考基因組中該基因的差異，也發(fā)現(xiàn)在‘Charleston Gray（長(zhǎng)瓜）參考基因組中有1個(gè)159 bp缺失，而在‘97103（圓瓜）參考基因組中則沒(méi)有該缺失。因此推測(cè)Cla011257為控制西瓜果實(shí)長(zhǎng)圓的候選基因。根據(jù)該缺失片段，開發(fā)出一個(gè)indel標(biāo)記，將該標(biāo)記在100份西瓜種質(zhì)資源中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記和西瓜果實(shí)形狀緊密連鎖（原圖5）。通過(guò)蛋白功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因編碼IQD蛋白。（3）將花期的根、莖、葉、花以及不同發(fā)育時(shí)期的子房、果皮、果肉進(jìn)行候選基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析，最終發(fā)現(xiàn)在授粉當(dāng)天該基因有最高表達(dá)量，這也解釋了授粉當(dāng)天果形指數(shù)有最大值的原因，子房的形狀也決定了成熟后果實(shí)的形狀。

結(jié)? ? 論：本研究首先明確了西瓜果實(shí)形狀的遺傳為單基因不完全顯性遺傳，即純合顯性（OO）為長(zhǎng)果，雜合（Oo）為橢圓果，純合隱性（oo）為圓果。通過(guò)BSA測(cè)序和GWAS重測(cè)序相結(jié)合的方法將控制西瓜果實(shí)形狀的基因定位于3號(hào)染色體26.817～26.863 Mb的區(qū)域內(nèi)，通過(guò)深入研究，最終確定Cla011257基因在長(zhǎng)果西瓜中有1個(gè)159 bp缺失，造成了53個(gè)氨基酸缺失;而在圓瓜中無(wú)該缺失。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)镮QD蛋白家族成員。