組織芯片多重免疫組織化學(xué)染色方法的優(yōu)化

許 特，王 筠，鄧 芳,，李延鵬，屈軍樂(lè)，顏鴻飛，盛司潼

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳518055；2)深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060；3)西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710004；4)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，廣東汕頭 515000

迄今，免疫組織化學(xué) (immunohistochemistry，IHC)技術(shù)已廣泛用于生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床病理學(xué)等學(xué)科中，依據(jù)抗原與抗體特異性免疫反應(yīng)為基本原理，是原位檢測(cè)細(xì)胞、組織和器官等形態(tài)學(xué)多種指標(biāo)的重要技術(shù)手段[1]．SHI等[2-4]發(fā)明抗原加熱修復(fù)法，可有效暴露并解鏈?zhǔn)灠窠M織中因甲醛固定所形成的分子交聯(lián)，使抗原決定簇充分暴露，從而增強(qiáng)抗原與抗體的特異性免疫顯色效應(yīng)．該技術(shù)極大地?cái)U(kuò)展了IHC在組織胚胎發(fā)育學(xué)與病理學(xué)的基礎(chǔ)研究，以及分子病理學(xué)的臨床應(yīng)用．隨著IHC技術(shù)方案和使用工具的不斷革新和改良，目前已從對(duì)單一已知抗原的檢測(cè)，發(fā)展至雙重甚至多重抗原的檢測(cè)[5]，并從對(duì)單一組織切片染色，演變到對(duì)同一玻片排列的上百?gòu)埼⑿褪灲M織切片染色．現(xiàn)有技術(shù)手段不僅能夠同時(shí)觀察多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與分布位置，還可通過(guò)共定位分析蛋白質(zhì)之間可能的互相作用關(guān)系，甚至通過(guò)追蹤疾病發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，挖掘長(zhǎng)期歸檔的、罕見(jiàn)病變的，以及微量組織標(biāo)本的潛在生物學(xué)與病理學(xué)信息．但是，現(xiàn)有的多重IHC染色技術(shù)在組織芯片上的應(yīng)用還存在缺陷．例如，經(jīng)多次重復(fù)的抗原修復(fù)后，組織切片上陽(yáng)性信號(hào)會(huì)出現(xiàn)明顯的衰減、丟失，以及組織結(jié)構(gòu)破損或脫片等. 本研究基于常規(guī)的IHC技術(shù)流程，根據(jù)組織芯片特點(diǎn)，改良多重染色技術(shù)的關(guān)鍵步驟，包括玻片濾紙夾層工具的研發(fā)、抗原修復(fù)液的優(yōu)選，以及用蒸蛋器替代微波爐加熱等，可為大通量微型組織切片的高能應(yīng)用提供新的技術(shù)手段和實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本與抗體

石蠟包埋甲醛固定的人胃癌和肝癌組織散片由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供．胃癌組織芯片購(gòu)自西安艾麗娜公司．抗AKT、cleaved Caspase-3和p53抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司．抗Estrogen Receptor-α和Erk1+Erk2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司．

1.2 抗原修復(fù)液

選用常用的檸檬酸鈉(pH=6.0)、專(zhuān)用IHC-TekTM、檸康酐(pH=7.5)、Tris-EDTA(pH=9.0)和Tris-HCL (pH=9.0)進(jìn)行染色效果的比對(duì)．

1.3 抗原修復(fù)技術(shù)的改良

多重免疫組織化學(xué)染色法見(jiàn)文獻(xiàn)[6-7].本研究提出改良的方法為：

微波加熱抗原修復(fù)：將組織切片浸入候選的抗原修復(fù)液中，用微波爐以2 min間隔加熱20 s，重復(fù)5次后自然冷卻到室溫．

專(zhuān)用蒸鍋加熱抗原修復(fù)：將抗原修復(fù)液放入實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用的抗原修復(fù)蒸鍋中預(yù)熱15 min，然后將組織切片浸入修復(fù)液中蒸汽加熱15 min，再自然冷卻到室溫．

票夾蒸鍋加熱抗原修復(fù)：將排列組織切片的載玻片面朝上覆蓋一張空白玻片(即組織切片置于兩張載玻片之中)，順時(shí)針略錯(cuò)開(kāi)些縫隙，用票夾夾住固定，放入已預(yù)熱的抗原修復(fù)液中，蒸汽加熱15 min后自然冷卻到室溫．

濾紙夾層-蒸蛋器加熱抗原修復(fù)：在組織切片四周覆蓋3～5層具有良好通透性和吸水性的厚層濾紙(略高于組織切片厚度)，在上面覆蓋一張空白玻片，形成中間鏤空的夾層(圖1)，然后用票夾固定，放入含抗原修復(fù)液的小染色缸中，再置于家用蒸蛋器中100 ℃加熱15 min，自然冷卻到室溫．

圖1 “濾紙夾層-蒸蛋器”抗原修復(fù)新裝置示意圖Fig.1 The schematic diagram of “filter paper interlayer-egg steamer” antigen retrieval tool

1.4 多重免疫組織化學(xué)染色

采用合適抗體工作濃度，遵照常規(guī)IHC染片步驟，但用無(wú)毒TO(terpentine oil)透明劑替代二甲苯使組織切片脫蠟，并使用甘油明膠封片，退染前先在50～60 ℃水中去封片，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇和抗原修復(fù)脫色，顯微鏡下確認(rèn)無(wú)特異性染色后，再進(jìn)行下一個(gè)染色循環(huán)．

1.5 H&E染色

根據(jù)經(jīng)典H&E染色步驟[8]，本研究改良了脫蠟步驟．具體染色步驟為：① TO透明劑使組織切片脫蠟；② 用無(wú)水乙醇及體積分?jǐn)?shù)分別為90%、 80%和70%的乙醇梯度水化；③ 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline， PBS)清洗樣本；④ 蘇木素染細(xì)胞核并水洗；⑤ 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸酒精浸泡樣本1 s；⑥ 用伊紅染細(xì)胞漿并水洗；⑦ 依次用體積分?jǐn)?shù)為70%、80%和90%的乙醇至無(wú)水乙醇梯度脫水；⑧ TO透明劑透明并甘油明膠封片．

2 結(jié)果與分析

2.1 四種不同抗原修復(fù)工具的染色效果

IHC染色過(guò)程中，不同抗原修復(fù)方法對(duì)多重免疫組織化學(xué)的效應(yīng)影響大不相同[9-11]．本實(shí)驗(yàn)對(duì)使用微波爐、實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用傳統(tǒng)蒸鍋、票夾-蒸鍋、濾紙夾層-蒸蛋器4種抗原修復(fù)工具的染色效果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖2．由圖2可見(jiàn)，與傳統(tǒng)蒸鍋修復(fù)相比，微波加熱修復(fù)在多次染色-脫染-復(fù)染過(guò)程中對(duì)組織切片的損傷較大；在蒸氣修復(fù)中，傳統(tǒng)蒸鍋修復(fù)和票夾-蒸鍋修復(fù)在多次染色-脫染-復(fù)染過(guò)程中的抗原丟失情況較濾紙夾層-蒸蛋器嚴(yán)重；在第7次染色后，采用票夾-蒸鍋修復(fù)工具染色后的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度明顯降低；采用濾紙夾層-蒸蛋器修復(fù)的組織切片完整性較好，且染色信號(hào)無(wú)明顯衰退．

圖2 四種不同的抗原修復(fù)法在同樣本-同抗體多次免疫組化技術(shù)中的效果比較(放大200倍)Fig.2 Comparison of effects of four antigen retrieval tools in multiple IHC

2.2 檸康酐抗原修復(fù)液顯示較強(qiáng)且穩(wěn)定的染色效應(yīng)

在IHC多重染色實(shí)驗(yàn)中，不同抗原修復(fù)液因其成分和pH值的不同，對(duì)同一抗體的染色效果有很大差異，且同一抗原修復(fù)液對(duì)不同類(lèi)型的抗體染色效果也不同[12-14]．為尋找通用性高，且經(jīng)得住多次染色-脫色-再染色，效果穩(wěn)定的抗原修復(fù)液，本研究選擇對(duì)同一組織切片樣本進(jìn)行多種抗體的IHC染色實(shí)驗(yàn)．5種抗原修復(fù)液分別為檸檬酸鈉(pH=6.0)、IHC-TekTM、檸康酐(pH=7.5)、Tris-EDTA(pH=9.0)和Tris-HCL(pH =9.0)，抗體分別為抗細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的抗體(AKT、p53、Estrogen Receptor-α、cleaved Caspase-3和 Erk1+Erk2)．圖3顯示了5種抗原修復(fù)液在同樣本-不同抗體的免疫組化技術(shù)中的實(shí)驗(yàn)效果．由圖3可見(jiàn)，5種抗體經(jīng)檸康酐、Tris-EDTA和Tris-HCL這3種抗原修復(fù)液處理的染色陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度都明顯高于另外兩種修復(fù)液．而在同一組織切片中，對(duì)同一抗體進(jìn)行多次IHC染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(請(qǐng)掃描論文末頁(yè)右下角二維碼)顯示，檸康酐抗原修復(fù)液處理的組織切片仍顯示較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào).

圖3 五種抗原修復(fù)液在同樣本-不同抗體的免疫組化技術(shù)中的效果比較(放大200倍)Fig.3 Effects of five antigen retrieval buffers in multiple IHC

2.3 TO透明劑可代替有毒二甲苯的脫蠟透明作用

通過(guò)H&E染色和IHC多重染色，比較TO透明劑和二甲苯在組織上的染色效果，結(jié)果如圖4．由圖4可見(jiàn)，對(duì)于常規(guī)使用的有毒二甲苯和無(wú)毒的TO透明劑，兩者具有相同效果的脫蠟與透明作用．

圖4 TO透明劑和二甲苯對(duì)石蠟切片脫蠟透明的效果比較 (放大200倍)Fig.4 Effects of TO or xylene agent in IHC and H&E stainings

3 討 論

目前中國(guó)的基礎(chǔ)研究和臨床病理研究最常用的抗原修復(fù)法是微波爐加熱修復(fù)和高壓鍋加熱修復(fù)．但是，輻射與高壓對(duì)操作人員均有一定的危險(xiǎn)性．另外，這兩個(gè)工具在對(duì)組織微型切片進(jìn)行多次抗原修復(fù)時(shí)，其加熱水分子的旋渦震蕩對(duì)組織細(xì)胞具有較強(qiáng)的沖擊力，可導(dǎo)致組織切片破損、脫落及抗原丟失，令多重染色的次數(shù)明顯受限．

1)抗原修復(fù)裝置的優(yōu)化．設(shè)計(jì)濾紙夾層-蒸蛋器的抗原修復(fù)輔助裝置，該裝置的優(yōu)點(diǎn)在于明顯縮小了液體在組織切片表面可流動(dòng)的空間和力度，即減少了水分子在加熱時(shí)對(duì)組織切片的沖擊力．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒸鍋修復(fù)較微波修復(fù)力度緩和，能起到保護(hù)組織完整性的作用(圖2第1和第2列)；而使用濾紙夾層-蒸蛋器修復(fù)，比專(zhuān)用蒸鍋和票夾-蒸鍋修復(fù)的陽(yáng)性染色信號(hào)更明顯(圖2第3列)，還可減少抗原修復(fù)液的用量．

2)抗原修復(fù)液的篩選．本研究對(duì)多重免疫組織化學(xué)法所需的抗原修復(fù)液進(jìn)行了優(yōu)選. 將國(guó)內(nèi)外較常用的5種抗原修復(fù)液對(duì)表達(dá)在組織細(xì)胞不同部位的5種抗體進(jìn)行了比較分析．實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，檸康酐(pH=7.5)緩沖液對(duì)多種抗體在組織切片上的多次染色-脫色-復(fù)染處理，都取得了最好的染色效果．此結(jié)果也驗(yàn)證了前人在石蠟包埋組織散片上的效果[15]．

3)對(duì)石蠟切片透明方法的改良．二甲苯作為石蠟組織的脫蠟劑、透明劑和封固劑，在病理界得到了廣泛使用．但其揮發(fā)性強(qiáng)、毒性大，易對(duì)長(zhǎng)期接觸者造成身體傷害[5]，令接觸者出現(xiàn)如頭暈、肢體震顫、失眠和免疫力下降等身體中毒癥狀，危害其中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響人體造血機(jī)能，易導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生，因此已被公認(rèn)為有毒致癌物質(zhì)[16-17]．TO透明劑作為替代品，其主要成分為松節(jié)油，氣味芬香，對(duì)人體無(wú)害[18]．雖然TO透明劑的無(wú)毒特征早已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但多年來(lái)許多病理工作者和科研人員并不清楚這兩者染色效果的差異，以及對(duì)組織芯片微型切片的影響，仍習(xí)慣性使用二甲苯．為全面推廣TO透明劑的使用，本研究通過(guò)H&E染色和IHC染色對(duì)這兩種脫蠟劑的整體效果進(jìn)行分析．結(jié)果表明，無(wú)論是組織切片的脫蠟與透明狀態(tài)、組織完整性和抗原敏感性，TO透明劑的效果均類(lèi)似二甲苯．

結(jié) 語(yǔ)

本研究主要聚焦于在組織芯片上多重IHC染色技術(shù)的改良與優(yōu)化．研究結(jié)果表明：自主設(shè)計(jì)的濾紙夾層-蒸蛋器的抗原修復(fù)輔助裝置，既可以保護(hù)組織切片的完整性，又能維持抗原檢測(cè)的敏感性和穩(wěn)定性．經(jīng)過(guò)多種抗原修復(fù)液的比對(duì)，推薦將多抗體通用型和多復(fù)染穩(wěn)定型的檸康酐(pH=7.5)緩沖液作為組織芯片多重染色的首選抗原修復(fù)液．對(duì)于透明劑的選擇，我們推薦使用無(wú)毒的TO透明劑取替有毒的二甲苯. 本研究為組織芯片的多重染色提供了更加實(shí)用、有效、廉價(jià)、方便且安全的方法，可提升與擴(kuò)展組織芯片在病理學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值．