SLC45A2 基因在“豫粉1 號”淺蘆花羽色中的表達及酪氨酸對其在黑色素細胞中表達量的影響

宋素芳，宋幸輝，藺成剛，李東華，王鑫磊，孫桂榮

（1.河南牧業(yè)經濟學院動物科技學院，河南鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州 450002）

羽色是家禽最顯著的表型特征之一，在家禽育種中是一個重要的育種性狀?！霸シ? 號”蛋雞H 系具有淺蘆花羽色性狀，成年雞頸部背部毛色為淺蘆花羽色，頸腹側為白色羽毛，具有伴性遺傳特點，可作為羽色自別雌雄的重要分子遺傳標記。淺蘆花羽色性狀作為“豫粉1 號”蛋雞的典型特征備受育種者關注，然而調控淺蘆花羽色性狀的基因一直尚未確定。

膜相關轉運蛋白SLC45A2（Solute Carrier Family 45 Member 2）是SLC45A（Solute Carrier Family 45）游離載體家族成員之一[1]，是一種調節(jié)黑色素合成的轉運蛋白，在黑色素生成中發(fā)揮重要作用[2]。SLC45A2基因的突變影響酪氨酸酶的加工，導致人類的眼、皮膚白化病[3-4]。SLC45A2 基因的突變在狗[5]、馬[6]、鵪鶉[7]、雞[2]、鼠[8]等動物中也會引起色素沉著的變化。目前，對于淺蘆花羽性狀的研究還比較少，從遺傳角度揭示該性狀的遺傳規(guī)律和調控機制，對于家禽育種工作具有十分重要的意義。本實驗旨在通過研究SLC45A2 在“豫粉1 號”蛋雞H 系不同部位毛囊中的表達量以及在黑色素細胞中添加不同濃度的酪氨酸對SLC45A2 表達量的影響，并對SLC45A2 進行生物信息學分析，為“豫粉1 號”H系淺蘆花羽色性狀的分子遺傳學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機選取發(fā)育140 d 的成年“豫粉1 號”H系母雞（由河南農業(yè)大學種雞站提供）6 只，實驗組為頸部背側組（頸背側具有黑白相間的蘆花色羽毛），對照組為頸部腹側組（頸腹側白色羽毛）。人工將雞頸部背側和腹側羽毛進行拔毛，強制換羽，到10 d 待其長出新的羽毛后進行樣品采集，用尖頭手術眼科鑷子輕輕提起羽毛，剪刀連其周圍的皮膚剪掉（注意要保留完整毛囊，周圍皮膚和皮下組織盡量少取），放入裝有RNA 保存液的1.5 mL 去RNA 酶離心管中，而后迅速放入液氮中冷凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗儀器及試劑 紫外分光光度計（NanoDro）、凝膠成像儀 SYNGENE GBOX（美國），熒光定量儀（羅氏）、臺式高速冷凍離心機Neofuge 23R（臺灣力康）、Trizol（TaKaRa 公司）、氯仿、異戊醇、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris-Cl）、2×Taq PCR Master Mix（北京康為世紀生物科技有限公司）、滅菌的超純水、反轉錄試劑盒（PrimerScriptTMRT reagent Kit，TaKaRa公司）、Agarose 瓊脂糖（西班牙進口），雞黑色素細胞，Medium254（Gbico），人黑色素細胞生長添加物（HMSG，Gbico）。

1.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物設計與合成 根據NCBI 上的雞SLC45A2（NM_001083364.2）序列，使用NCBI 在線數據庫設計引物（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=9031&INPUT_SEQUENCE=NM_001083364.2&LINK_LOC=nuccore），主要參數為產物的大小在200 bp 左右，退火溫度55～65℃，上、下游引物大小在20 bp 左右，所設產物至少橫跨1 個內含子。內參基因β-actin 的引物序列由河南農業(yè)大學家禽種質資源創(chuàng)新工程研究中心提供，引物設計完成后由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物信息

1.4 雞黑色素細胞SLC45A2 驗證 第4 代對數生長期的雞黑色素細胞，設置培養(yǎng)基分為不添加酪氨酸組和分別添加10-9、10-8、10-7、10-6mol/L 酪氨酸培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)黑色素細胞，接種于6 孔板，每組3 個重復孔，重復3 次。置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后收取細胞。

1.5 RNA 提取與反轉錄 采用Trizol 的方法進行毛囊組織和黑色素細胞RNA 的提取，利用微量紫外分光光度計測定RNA 濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性檢測。質量良好的RNA，參考TaKaRa 反轉錄試劑盒說明書的操作步驟進行反轉錄反應。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）反應 采用Roche LightCycler 96 實時熒光定量系統(tǒng)（羅氏，瑞士）和SYBR Green I 染料法進行qPCR，用管家基因β-actin 作為內參，每個樣品3 個技術重復。20 μL 反應體系：2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA 2 μL（500ng/uL），加雙蒸水至20 μL。反應程序：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，40 個循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計分析 用2-ΔΔCt法來計算目的基因的相對表達量，采用SPSS 21.0 軟件對數據分別進行獨立樣本t 檢驗，單因素方差分析；用GraphPad Prism7.0 軟件作圖。結果表示為平均值±標準差。

1.8 SLC45A2 基因編碼蛋白的生物信息學分析 依據NCBI 提供的BLAST 程序查找SLC45A2 基因編碼蛋白序列；氨基酸翻譯使用SDSC Biology Workbenc；氨基酸序列的信號肽預測使用Signal P Server 4.1；跨膜域預測使用TMHMM Server v. 2.0，預測SLC45A2 基因的理化性質和疏水性。

2 結果與分析

2.1 不同部位羽色基因SLC45A2 的表達分析 如圖1所示， SLC45A2 在頸部背側淺蘆花羽色的表達量顯著高于腹側白色的表達量。

圖1 SLC45A2 在頸部背側和腹側的相對表達量

2.2 黑色素細胞中添加不同濃度酪氨酸對SLC45A2 表達量的影響 由圖2 可知，與對照組相比，黑色素細胞中添加10-9、10-8mol/L 酪氨酸使SLC45A2 表達量顯著增高，濃度為10-8mol/L 時 SLC45A2 表達量最大。說明黑色素細胞中添加酪氨酸可以促進SLC45A2 表達，10-8mol/L 是酪氨酸在黑色素細胞中促進SLC45A2 表達的最大添加劑量；但超過10-8mol/L 引起SLC45A2的表達量顯著下降，與空白對照組差異不顯著。

圖2 添加不同濃度酪氨酸黑色素細胞中SLC45A2 的表達量

2.3 SLC45A2 的信號肽 由圖3 可知，C 值（原始剪切位點得分）為0.110，S 值（信號肽分數）為0.138，Y 值（被結合的剪切位點的分數）為0.109，不符合1個典型信號肽（S 值在切割位點之前高，而在切割位點之后降低，C、Y 值趨向于+1）的標準，暗示雞的SLC45A2 不存在信號肽。

圖3 SLC45A2 基因的信號肽

2.4 SLC45A2 基因的跨膜區(qū) 如圖4 所示，SLC45A2存在12 個跨膜區(qū)，編碼蛋白為跨膜蛋白。

圖4 SLC45A2 基因的跨膜區(qū)

2.5 SLC45A2 的疏水性 如圖5 所示，第246 位氨基酸得分最高為3.789，說明在該位點的疏水性最強；第478 位氨基酸得分最低為-2.856，表示該位點的親水性最弱。整條多肽鏈呈現為疏水性，因此可以判斷SLC45A2 基因編碼蛋白為不可溶性蛋白。

3 討 論

“豫粉1 號”蛋雞是河南農業(yè)大學2015 年培育出的新的配套系，該品種是國內唯一的土種蛋雞羽速、羽色雙自別雌雄配套系，充分利用了矮小和淺蘆花羽基因的伴性遺傳。“豫粉1 號”蛋雞的淺蘆花羽色性狀作為品種的典型特征備受育種者關注，通過查閱資料及前人的研究結果，篩選出了控制羽色性狀的候選基因SLC45A2。

圖5 SLC45A2 基因的疏水性

本實驗發(fā)現SLC45A2 基因在“豫粉1 號”蛋雞H 系頸部的不同羽色的表達量存在顯著差異，說明它與“豫粉1 號”蛋雞H 系淺蘆花羽色的形成相關。Qiu 等[4]研究表明SLC45A2 的突變和白化病有關。王海東等[9]認為，SLC45A2 在不同毛色小鼠皮膚中的表達存在差異性，以及 過 表 達SLC45A2 后MITF、TYR、TYRP1、TYRP2以及黑色素含量都發(fā)生明顯變化，表明SLC45A2 通過調節(jié)黑色素的生成進而參與毛色的形成。Wei 等[10]研究表明，SLC45A2 在1 月齡灰、白羽朗德鵝皮膚中顯著差異表達，SLC45A2 基因在黑色素生物合成過程中發(fā)揮作用。

黑色素是影響動物羽色形成的主要物質基礎，黑色素受一系列相關基因的復雜調控和外在因素影響，進而影響黑色素的沉積和分布。大量研究表明，黑色素的合成主要是酪氨酸在酪氨酸酶的作用下，經過一系列的生物化學反應而形成的，以不同的形式在動物體表現出來。本實驗結果表明黑色素細胞中添加酪氨酸后，SLC45A2表達量增加。SLC45A2 表達量在酪氨酸添加劑量為10-8mol/L 時達最高，之后隨著濃度的增加，SLC45A2的表達量反而有所降低，這說明SLC45A2 在黑色素細胞中的表達對酪氨酸存在一定的劑量依賴關系。同時也說明黑色素細胞中添加不同濃度的酪氨酸可以影響淺蘆花羽色的形成，但具體的調控機制還需要進一步研究。

綜上所述，SLC45A2 在“豫粉1 號”不同羽色中的表達存在差異，黑色素細胞中添加酪氨酸后SLC45A2 的表達量上升，表明SLC45A2 通過調節(jié)黑色素的生成進而參與毛色的形成，為SLC45A2 參與毛色形成的分子基礎提供新的依據。通過生物信息學對SLC45A2 信號肽、跨膜區(qū)和疏水性等方面進行分析，表明該基因為跨膜蛋白、不可溶性蛋白，為進一步從蛋白水平研究其生物學功能提供參考。