氧化型低密度脂蛋白與急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者CD4+T細(xì)胞Notch1、Notch2表達(dá)的相關(guān)性研究

朱家平，朱李茹

（襄陽市中心醫(yī)院，湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，襄陽 441021）

冠心病是指由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使血管腔狹窄甚至堵塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，在中醫(yī)學(xué)中屬于“胸痹”“心痛”“真心痛”等范疇[1]。中醫(yī)學(xué)對(duì)冠心病的治療積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。目前益氣養(yǎng)陰、活血化瘀治療冠心病的療效已被包括西醫(yī)在內(nèi)的醫(yī)學(xué)界所確認(rèn)。目前，中藥在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，其中茶色素治療冠心病患者能夠抑制體內(nèi)低密度脂蛋白的氧化，降低了患者血漿中氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的水平[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者或動(dòng)物模型均出現(xiàn)輔助性T細(xì)胞（Th）的異?；罨?，主要是促炎的Th1升高及抗炎的Th2降低，然而出現(xiàn)這種現(xiàn)象的機(jī)制尚未闡明[3-5]。ox-LDL是冠心病發(fā)生的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，ox-LDL在血管內(nèi)膜上的堆積會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)，導(dǎo)致其分泌炎性因子和趨化因子，進(jìn)一步引起炎癥因子釋放和免疫激活[6-7]。有研究報(bào)道，ox-LDL可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化[8]，而Notch信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)T細(xì)胞的分化過程[9]。因此，筆者探討了ox-LDL與急性冠狀動(dòng)脈綜合征（ACS）患者CD4+T細(xì)胞Notch1、Notch2表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料及方法

1.1 主要試劑 人源ox-LDL（北京協(xié)生生物科技有限公司，批號(hào)：SY0441）；APC標(biāo)記小鼠抗人Notch1、PE標(biāo)記小鼠抗人Notch2單抗（Sigma公司）；白細(xì)胞介素 4（IL-4）-PE、干擾素 γ（TNF-γ）-PE（Sigma公司）；人源ox-LDL ELISA試劑盒（武漢華美生物有限公司，批號(hào)：ab14526-65）。

1.2 研究對(duì)象 收集2016年3月—2017年10月本院確診的冠心病患者88例，男49例，女39例，平均年齡為（53.64±11.43）歲，其中[ACS患者56例，急性心肌梗死（AMI）患者26例，不穩(wěn)定型心絞痛（UA）患者 30例]，穩(wěn)定型心絞痛（SA）患者 32例，另外納入同期健康體檢者30例，男17例，女13例，平均年齡為（54.64±12.63）歲?；颊呓M與對(duì)照組之間年齡和性別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。同時(shí)排除出現(xiàn)感染性疾病、癌癥、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、近期服用非甾體抗炎藥或免疫抑制劑的人群。并且每位納入對(duì)象均簽署知情同意書。

1.3 血漿ox-LDL水平分析 將血漿標(biāo)本放置室溫平衡，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分選CD4+T細(xì)胞 采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周單個(gè)核細(xì)胞[10]。將分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)5 h，棄去貼壁細(xì)胞，便得到淋巴細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×107，加入Percp/cy 5.5標(biāo)記小鼠抗人CD3、FITC標(biāo)記小鼠抗人CD4抗體，室溫避光孵育0.5 h，PBS清洗2遍，重懸后流式細(xì)胞儀分選CD4+T細(xì)胞。并采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)Th1、Th2細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞Notch表達(dá) 從健康人群中分離得到CD4+T細(xì)胞接種于6孔板，隨機(jī)將細(xì)胞分為4組，及對(duì)照組、低、中、高劑量ox-LDL 組（40、80、160 mg/L），每組設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔。共孵育72 h后，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗2遍，每組細(xì)胞再分為兩組，分別加入濃度為0.2 g/L的APC標(biāo)記小鼠抗人Notch1、PE標(biāo)記小鼠抗人Notch2單抗，室溫避光反應(yīng)0.5 h，PBS清洗后離心、重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Notch1、Notch2表達(dá)。

1.6 數(shù)據(jù)分析 計(jì)量資料采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料比較 4組研究對(duì)象在年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙及HDL-C水平等方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，UA組和AMI組患者TC、TG及LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），而SA組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，UA組與AMI組相比也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組CD4+T細(xì)胞Notch1和Notch2表達(dá)、Th1/Th2比值及ox-LDL水平 UA組、AMI組CD4+T細(xì)胞Notch1、Notch2表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），而Th1/Th2比值及ox-LDL水平相對(duì)于對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。CD4+T細(xì)胞Notch1和Notch2表達(dá)、Th1/Th2比值及ox-LDL水平在SA組和對(duì)照組之間相比無明顯差異，UA組與AMI組相比也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表2。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ACS患者（UA組、AMI組）外周血ox-LDL與Notch1（r=-0.653，P＜0.01）、Notch2（r=-0.468，P＜0.01）表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，與Th1/Th2比值呈明顯正相關(guān)（r=0.582，P<0.01）。見圖 1。

表1 各組患者一般臨床資料Tab.1 General clinical data of patients of each group

表2 各組CD4+T細(xì)胞Notch1和Notch2表達(dá)、Th1/Th2比值及 ox-LDL水平（x±s）Tab.2 Expression of Notch1，Notch2 in CD4+T cells，Th1/Th2 ratio and levels of ox-LDL in each group（x±s）

2.3 ox-LDL對(duì)ACS患者CD4+T細(xì)胞Notch表達(dá)的影響 采用ox-LDL刺激流式分選的人外周血CD4+細(xì)胞72 h，對(duì)照組、低、中、高劑量ox-LDL組中Notch1 表達(dá)分別為（1.05±0.25）%、（0.84±0.23）%、（0.62±0.17）%及（0.31±0.14）%，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量ox-LDL組均顯著降低（P＜0.05）。除此之外，對(duì)照組、低、中、高劑量ox-LDL組中 Notch2表達(dá)分別為（8.26±1.43）%、（5.34±1.30）%、（3.27±0.85）%及（1.39±0.64）%，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量ox-LDL組均顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

圖1 各指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analyses of each indicator

圖2 ox-LDL對(duì)CD4+T細(xì)胞Notch表達(dá)的影響（x±s）Fig.2 Effects of ox-LDL on the expression of Notch in CD4+cells（x±s）

冠心病屬于多因素的大動(dòng)脈炎性病變，而炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答起著關(guān)鍵性作用。CD4+T細(xì)胞依據(jù)分泌的細(xì)胞因子和功能不同分為Th1和Th2亞群，Th1主要生理作用是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)。Th2的主要生理作用是促使體液免疫和免疫調(diào)節(jié)，并且Th1/Th2比例失衡會(huì)誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生[11]。本研究用白細(xì)胞介素 4（IL-4）-PE、干擾素 γ（TNF-γ）-PE分別作為Th1和Th2細(xì)胞的標(biāo)志，結(jié)果提示ACS患者Th1/Th2比值相對(duì)于對(duì)照組顯著升高。說明ACS患者存在Th1/Th2比例失衡，機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)受到破壞，這可能與ACS患者細(xì)胞免疫功能紊亂和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理過程相關(guān)。

ox-LDL是導(dǎo)致冠心病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素，由于ox-LDL的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。ox-LDL在引起動(dòng)脈粥硬化過程中，會(huì)導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，提出冠心病患者血漿中ox-LDL水平的升高，代表著ACS的出現(xiàn)，并且ox-LDL水平與ACS病情有著密切聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)ACS患者ox-LDL水平相對(duì)于健康對(duì)照組顯著升高，早期研究表明ox-LDL能明顯誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Notch1受體的表達(dá)，提示Notch信號(hào)通路參與冠心病的發(fā)生[13]。ox-LDL作用機(jī)制主要通過TLR2/4受體活化巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)Notch配體Jagged1上調(diào)，產(chǎn)生大量促炎因子。研究發(fā)現(xiàn)UA組、SA組CD4+T細(xì)胞Notch1、Notch2表達(dá)相對(duì)于健康對(duì)照組顯著降低；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ACS患者外周血ox-LDL與Notch1、Notch2表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，與Th1/Th2比值呈明顯正相關(guān)。

接著在體外研究了ox-LDL刺激對(duì)分離出的CD4+T細(xì)胞Notch1、Notch2表達(dá)的影響，結(jié)果表明低、中、高劑量的ox-LDL均能明顯抑制Notch1、Notch2的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Notch2信號(hào)可誘導(dǎo)Th2的分化，Notch1/Notch2信號(hào)通路可誘導(dǎo)GATA-3和IL-4的上調(diào)來促使Th2的分化，而不是作用于IL-4/STAT6信號(hào)通路[14]。早期研究也發(fā)現(xiàn)中藥參參康心能誘導(dǎo)Notch信號(hào)通路活化，進(jìn)而對(duì)冠心病氣虛血疲證小鼠具有保護(hù)作用[15]。由此可推測(cè)，參參康心可能是通過促使Notch信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞向抗炎的Th2細(xì)胞分化，機(jī)體起著免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而緩解了冠心病氣虛血疲證小鼠的癥狀。綜上所述，ox-LD可抑制Notch1/Notch2的表達(dá)來降低Th2的分化，并且Th2與Th1在體內(nèi)相互作用，抑制Th2分化，便是促使Th1的分化。總之，ox-LDL能明顯抑制人外周血CD4+T細(xì)胞Notch1、Notch2分子表達(dá)，可能與ox-LDL抑制Th2分化而促進(jìn)Th1異常分化有關(guān)，參與冠心病的發(fā)生發(fā)展。