一株提高植物幼苗耐受Cr⁶⁺細(xì)菌(Exiguobacterium sp.S2)的分離與鑒定

周曉倫 萬(wàn)建新 王衛(wèi)衛(wèi) 張偉 姚彥紅 高蕓

摘要：植物促生菌因其具有對(duì)植物生長(zhǎng)促進(jìn)及增強(qiáng)抗逆性等優(yōu)點(diǎn)，在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤中具有良好的應(yīng)用潛力，能為環(huán)境生物修復(fù)以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種資源，實(shí)現(xiàn)其更大范圍的應(yīng)用。以甘肅省平?jīng)鍪形廴就寥乐蟹蛛x得到的Cr6+耐受菌株為目的菌，測(cè)定菌株的促植物生長(zhǎng)特性（產(chǎn)IAA、溶磷、ACC脫氨酶活性），采用改良的Belimov方法篩選出1株促生特性較好的菌株，進(jìn)行生理生化及16S rRNA基因序列分析鑒定。初步分離得到32株Cr6+耐受菌株，根據(jù)改良的Belimov方法篩選出1株S2菌株，通過(guò)生理生化及16S rRNA鑒定S2菌株為Exiguobacterium sp.，GenBank登錄號(hào)為MH180821。玉米幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)表明，與不同Cr6+濃度處理組相比，接種了S2菌株的玉米幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、葉面積都有顯著提高，平均根長(zhǎng)分別增加95.74%、41.34%、194.12%，平均莖長(zhǎng)分別增加32.03%、-30.13%、28.96%，平均葉面積分別增加73.94%、35.17%、26.92%，平均鮮質(zhì)量分別增加33.33%、33.62%、-20.00%，其顯著提高了玉米幼苗對(duì)Cr6+的耐受性。該研究表明，Exiguobacterium sp.S2在污染土壤中能夠更好地定殖并保護(hù)促植物生長(zhǎng)能力的發(fā)揮，為重金屬污染土壤的植物-微生物聯(lián)合原位修復(fù)提供了良好的微生物資源。

關(guān)鍵詞：玉米幼苗;Cr6+耐受菌株;ACC脫氨酶;吲哚乙酸;微小桿菌

中圖分類(lèi)號(hào)： X53;S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0273-05

在過(guò)去幾十年的工業(yè)領(lǐng)域中，大量的使用重金屬[鉻（Cr）、鎳、銅、鋅、鉛、隔等]導(dǎo)致土壤和地下水污染，對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境造成重大的威脅。在不同的重金屬中，鉻是主要的污染物之一，由皮革制革、電鍍、采礦、紡織、金屬加工、化肥、染料和顏料制造等各種工業(yè)應(yīng)用產(chǎn)生[1]。Cr化合物對(duì)植物的毒性很大，不利于植物的新陳代謝。雖然許多植物不受低濃度Cr（3.8×10-4 μmol/L）的影響，但當(dāng)Cr濃度為 100 μmol/（L·kg）時(shí)，對(duì)高等植物有毒害[2]。外部環(huán)境存在的Cr改變了植物生長(zhǎng)發(fā)育的格局。已有研究表明根生長(zhǎng)的減少是由于樹(shù)木和植物中的重金屬[3]。

文獻(xiàn)調(diào)查表明，幾乎沒(méi)有人報(bào)道植物中鉻毒性的改良方法，主要原因在于大多數(shù)研究集中于通過(guò)樹(shù)木和植物促進(jìn)Cr的積累，達(dá)到植物修復(fù)的作用。Khan報(bào)道合歡樹(shù)、阿拉伯相思樹(shù)和印度黃檀這些樹(shù)種的菌根保護(hù)它們免受重金屬的毒害和制革廠廢水鉻的污染[4]。Karagiannidis等研究泡囊叢枝菌根真菌（漏斗孢球囊霉）對(duì)硬質(zhì)小麥生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)吸收的影響，證實(shí)泡囊叢枝菌根真菌（VAFM）能夠提高小麥的生物量和減少Cr在植物中的含量[5]。Davies等發(fā)現(xiàn)VAFM能夠增強(qiáng)向日葵耐受Cr的能力，VAFM對(duì)Cr處理植物的組織礦物濃度、生長(zhǎng)和氣體交換都有積極的作用[6-7]。正如Burd等陳述的，在重金屬污染的土壤中重金屬含量已經(jīng)超過(guò)了植物的耐受范圍，它可能會(huì)用根際微生物處理植物以此來(lái)增加植物的生物量，穩(wěn)定和修復(fù)被污染環(huán)境中的植物[8]。

植物對(duì)重金屬的耐受與其產(chǎn)生的一種多肽類(lèi)物質(zhì)有關(guān)，這種物質(zhì)能夠螯合重金屬，從而減少重金屬對(duì)植物根系酶的傷害[9]。植物根的活動(dòng)可能增加金屬、非金屬的溶解性，通過(guò)酸化、氧化還原反應(yīng)、分泌金屬螯合物或者有機(jī)配體與陰離子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)[10]。微生物通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)配體，分解土壤中的有機(jī)物質(zhì)或者分泌一些代謝物能夠改變金屬、非金屬之間的轉(zhuǎn)化[11]。土壤菌群和作物根之間相互作用對(duì)植物的發(fā)育和存活有著不可估量的作用[12]。數(shù)個(gè)植物相關(guān)細(xì)菌已被報(bào)道能夠加速重金屬污染的生物修復(fù)，通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在促進(jìn)植物修復(fù)中起著重要的作用[13-14]。這些植物促生菌能夠使宿主增長(zhǎng)和重金屬積累的過(guò)程可能包括（1）合成一些化合物[例如吲哚-3-乙酸、吲哚乙酸（IAA）、鐵載體、有機(jī)酸;1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶];（2）刺激一些代謝途徑（例如生物固氮和溶磷）;（3）改變金屬在植物中的遷移率和有效性。該研究從3個(gè)不同污染地區(qū)土壤中分離出32株Cr6+耐受細(xì)菌，采用改良的Belimov方法篩選出1株植物促生顯著的菌株，通過(guò)測(cè)定菌株的促生特性（IAA含量、溶磷能力、ACC脫氨酶活性），同時(shí)測(cè)定其抗重金屬能力，并基于16S rRNA基因序列及表型分析鑒定其種屬。以期得到一批優(yōu)良的土著植物促生菌，為進(jìn)一步利用微生物-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染提供一批微生物資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究中使用的所有化學(xué)藥品等級(jí)均為分析純，由西安姚北生物科技有限公司提供。Cr6+的儲(chǔ)備溶液（1 000 mg/L）：將2.829 g重鉻酸鉀（K2Cr2O7）溶于1 L無(wú)菌蒸餾水中，進(jìn)一步稀釋至工作濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Cr6+耐受菌株的分離 采用梅花法收集3個(gè)不同污染地區(qū)距地表15 cm的土壤：（1）甘肅省平?jīng)鍪袕R底下村（106.894074°E、35.49297°N）;（2）甘肅省平?jīng)鍪袕R底下村（106.897003°E、35.490824°N）;（3）甘肅省平?jīng)鍪卸镤伌澹?06.783376°E、35.508361°N）。準(zhǔn)確稱取3個(gè)不同地區(qū)土壤各10 g，分別加入盛有90 mL無(wú)菌水（含有25～35個(gè)玻璃珠）的錐形瓶中，置振蕩器上振蕩15 min，得到10-1濃度的土壤稀釋液，連續(xù)稀釋至10-11，將10-1～10-11梯度的土壤稀釋液均勻地涂布于含有100 mg/L Cr6+的LB培養(yǎng)基中，（35±2） ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取形態(tài)特征不同的菌落劃線至含有100 mg/L Cr6+的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每種菌株連續(xù)純化3代以上，最終使平板上的菌落形態(tài)和鏡檢的菌體形態(tài)一致，將純化的菌落劃線至牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面，4 ℃保藏，以備后續(xù)研究。共分離出32株Cr6+耐受細(xì)菌，其中菌株S2能顯著地提高玉米幼苗對(duì)Cr6+的耐受性，因此對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1.2.2 S2菌株的鑒定 菌株的形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法[15]進(jìn)行。

1.2.3 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 Cr6+耐受細(xì)菌送生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S rDNA擴(kuò)增及序列測(cè)定。提交菌株的16S rDNA序列到美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站，與已知的序列比對(duì)分析其同源性。利用ClustalX1.81將序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 5.05分子進(jìn)化遺傳分析軟件分析堿基組成、GC含量，利用Kimura2參數(shù)計(jì)算遺傳距離，采用NJ鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 S2菌株ACC脫氨酶活性和產(chǎn)IAA能力的測(cè)定 ACC脫氨酶分解ACC產(chǎn)生的α-酮丁酸用來(lái)測(cè)定ACC脫氨酶活性，參照Penrose等的方法測(cè)定α-酮丁酸含量[16]。根據(jù)Bradford方法測(cè)定菌體蛋白含量[17]。根據(jù)α-酮丁酸和蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定ACC脫氨酶活性。

將S2菌株挑1環(huán)到含有20 mL微量蔗糖鹽液體（SMS）培養(yǎng)基[蔗糖1%、（NH4）2SO4 0.1%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.05%、NaCl 0.01%、酵母提取物0.05%、CaCO3 0.05%，pH值7.2]的錐形瓶中28 ℃、140 r/min培養(yǎng)96 h，液體培養(yǎng)基中加入 0.5 mg/mL 的色氨酸。取1.5 mL懸浮液到2 mL離心管中 5 000 g 離心15 min，取上清液1 mL到5 mL比色管中加入 2 mL Salkowskis溶液，振蕩混勻室溫靜置20 min，比色管中溶液會(huì)出現(xiàn)粉紅色，在530 nm檢測(cè)粉紅色物質(zhì)的吸光度[18]。1個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，根據(jù)IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定菌株產(chǎn)IAA能力大小。

1.2.5 溶磷和Cr6+耐受試驗(yàn) 將待測(cè)菌株S2接種于含無(wú)機(jī)磷酸鹽的Pitkovskaya瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)5 d。若細(xì)菌菌落周?chē)霈F(xiàn)清晰的暈圈，表明細(xì)菌溶解無(wú)機(jī)磷酸鹽[19]。

將待測(cè)菌株劃線接種至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入 100～1 800 mg/L K2Cr2O7，50為1個(gè)梯度進(jìn)行菌株耐受Cr6+試驗(yàn)，倒置培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌株的生長(zhǎng)情況以此來(lái)確定生長(zhǎng)濃度和最低致死濃度。

1.2.6 S2菌株對(duì)不同Cr6+濃度下玉米幼苗生長(zhǎng)的影響 采用改良的Belimov等的方法確定根際細(xì)菌的植物促生根長(zhǎng)活性[20]。接種3株菌株S2、W3、S70至6 mL LB液體培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水懸浮菌體數(shù)為5×107 CFU/mL。1 mL細(xì)菌懸浮液或無(wú)菌水（未處理的對(duì)照組）加入到含有40 mL Hoagland半固體培養(yǎng)基[KNO3 607.00 mg、Ca（NO3）2·4H2O 945.00 mg、MgSO4·7H2O 493.00 mg、NH4 H2PO4 115.00 mg、H3BO3 2.86 mg、MnCl2·4H2O 2.13 mg、ZnSO4·7H2O 0.22 mg、CuSO4·5H2O 0.08 mg、H2MoO4·H2O 0.02 mg、FeSO4· 7H2O 5.57 mg、Na2-EDTA 7.45 mg]試管中（內(nèi)徑30 mm）[21]。處理組在半固體培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)腃r6+，濃度依次為10、50、100 mg/L，對(duì)照組不加金屬離子。用3% H2O2和95%乙醇（體積比1 ∶ 1）對(duì)白菜幼苗表面滅菌 20 min，無(wú)菌水沖洗數(shù)次至種子表面無(wú)氣泡產(chǎn)生，挑選15個(gè)種子到Hoagland半固體培養(yǎng)基，所有的試驗(yàn)處理組作3次重復(fù)。在光照培養(yǎng)箱中28 ℃黑暗培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)后測(cè)量玉米幼苗的根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、葉面積、鮮質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 one-way ANOVA進(jìn)行分析;多重比較采用Fishers Student-Newman-Keulsa，b。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr6+耐受菌株S2的分離與鑒定

從污染土壤中分離得到Cr6+耐受菌株S2，G+、短桿狀，在含有Cr6+營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成圓形濕潤(rùn)的橙黃色菌落。由表1可知，菌株S2觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，能還原硝酸鹽，水解明膠、淀粉和酪素，分解葡萄糖、蔗糖、半乳糖。根據(jù)菌體形態(tài)特征和生理生化，菌株S2為Exiguobacterium spp.。為了證實(shí)這一點(diǎn)，菌株的分子鑒定通過(guò)16S rDNA基因測(cè)序和基因Blast比對(duì)。由圖1可知，菌株S2與Exiguobacterium sp. SH20（KU696286.1）具有密切的同源性。菌株S2的16S rDNA序列以唯一的登錄號(hào)MH180821進(jìn)入GenBank。為了確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育位置，筆者使用NCBI獲得的序列及MEGA 5.10軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。

2.2 S2菌株ACC脫氨酶活性和產(chǎn)IAA能力測(cè)定

植物不斷地暴露在非生物脅迫中，例如干旱、重金屬等。引入含有ACC脫氨酶的植物促生菌到重金屬土壤中能夠緩解這種脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，植物促生菌能夠在這種脅迫下生存，并結(jié)合在種子的表面或者植物的根上，通過(guò)ACC脫氨酶降解乙烯的直接前體ACC來(lái)降低植物體內(nèi)乙烯的含量，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[22]。植物促生菌也通過(guò)合成IAA的方式促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，IAA直接刺激植物細(xì)胞的延生和分裂或者提高植物自身的防御系統(tǒng)[23]。Exiguobacterium sp. S2具有較高的產(chǎn)IAA能力和ACC脫氨酶活性，不溶解磷酸鹽（表2）。

2.3 Cr6+耐受菌株對(duì)不同Cr6+濃度下玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

玉米幼苗的根長(zhǎng)和葉面積對(duì)Cr6+效應(yīng)表明，玉米生長(zhǎng)容易受這種金屬的影響，這種效應(yīng)隨著重金屬濃度的增加會(huì)更明顯（表3）。接種3株Cr6+耐受菌株的玉米幼苗的根長(zhǎng)、葉面積結(jié)果表明，相對(duì)于未接種Cr6+耐受菌株的對(duì)照組，接種Cr6+耐受菌株有利于植物根和葉面積的生長(zhǎng);不同濃度Cr6+接種S70菌株的玉米幼苗根長(zhǎng)與對(duì)照組相比顯著減少;處于不同濃度的Cr6+時(shí)接種S2菌株有利于玉米根和葉面積的生長(zhǎng)（表3）;在不同濃度（10、50、100 mg/L）的Cr6+存在時(shí)，接種S2菌株的玉米幼苗的平均根長(zhǎng)分別增加95.74%、41.34%、194.12%，平均莖長(zhǎng)分別增加32.03%、-30.13%、28.96%，平均葉面積分別增加 73.94%、35.17%、26.92%，平均鮮質(zhì)量分別增加33.33%、33.62%、-20.00%。在不同濃度的Cr6+存在時(shí)，菌株S2、S70、W3接種的玉米幼苗的平均根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、葉面積都有所增加或者減少，相比之下Cr6+對(duì)植物根長(zhǎng)、葉面積影響比較大，對(duì)莖長(zhǎng)、鮮質(zhì)量的影響比較小，隨著濃度的增加這種響應(yīng)越明顯，再次證明Cr6+對(duì)白菜生長(zhǎng)的影響比較嚴(yán)重（表3）。

在該研究中S2菌株經(jīng)過(guò)測(cè)定，既含有ACC脫氨酶又能產(chǎn)生吲哚乙酸，不溶解磷酸鹽。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA初步鑒定為Exiguobacterium sp. S2。具有ACC脫氨酶活性的菌株通過(guò)減少乙烯含量幫助植物抵抗逆境脅迫，是因?yàn)锳CC脫氨酶水解ACC為α-酮丁酸和氨[24]。試驗(yàn)中不同濃度的Cr6+（10、50、100 mg/L）對(duì)玉米幼苗的生長(zhǎng)有毒害作用，但是當(dāng)接種Cr6+耐受菌株Exiguobacterium sp. S2后，玉米幼苗的根長(zhǎng)、葉面積明顯大于對(duì)照組。當(dāng)Cr6+濃度為100 mg/L時(shí)，接種S2、S70、W3菌株都有利于玉米幼苗根長(zhǎng)和葉面積的生長(zhǎng)，說(shuō)明3株Cr6+耐受菌株之間有顯著的差異性。

3 結(jié)論與討論

在重金屬環(huán)境中一些植物促生菌能夠顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)[11]。植物促生菌作為植物種子菌劑，應(yīng)用到含有重金屬的土壤中，已經(jīng)證明能夠根本性地減少重金屬對(duì)植物的毒害，同時(shí)提高植物的總體增長(zhǎng)和產(chǎn)量收益[25]。Bharti等研究了2種耐鹽PGPR，Bacillus pumilus STR2和深海細(xì)菌（Exiguobacterium oxidotolerans） STR36，其中從鹽堿土植物根際分離到的E. oxidotolerans STR 36菌株能夠分泌豐富的胞外多糖，緩解高鹽對(duì)植物體的脅迫，在原生鹽堿土、次生鹽堿土中接種Exiguobacterium oxidotolerans STR36的婆羅米植株生物量比未接菌分別高出109%、138%;植物體中活性物質(zhì)三萜皂苷假馬齒莧皂苷A（bacoside-A）含量比未接菌植株分別高出36%、76%[26]。本研究中接種菌株S2的玉米幼苗生物量與對(duì)照組相比分別增加33.33%、33.62%、-20.00%，也證實(shí)了這一點(diǎn)。Dastager等從印度喀拉拉邦省的西加特森林土壤中分離得到1株植物促生菌Exiguobacterium NⅡ-0906，NⅡ-0906菌株于30 ℃能溶磷 84.7 μg/（mL·d），合成嗜鐵素，分泌氫氰酸（HCN），可對(duì)常見(jiàn)的植物致病真菌產(chǎn)生拮抗作用，接種了NⅡ-0906菌株的植物根、莖和生物量均有顯著增加[27]。乙酰短桿菌（Exiguobacterium acetylicum） 1 P（MTCC 8707）是1株從蘋(píng)果果園根際土壤分離得到的細(xì)菌，MTCC 8707于15 ℃能溶磷（21.1±1.18） μg/（mL·d），合成嗜鐵素，分泌HCN，可對(duì)常見(jiàn)的植物致病真菌產(chǎn)生頡頏作用，MTCC8070具有分泌IAA的能力[28]。這2種E. spp.（Exiguobacterium NⅡ-0906、Exiguobacterium acetylicum 1P）不僅可以提高生物質(zhì)產(chǎn)量，并且能夠增強(qiáng)植物的抗逆性。

在重金屬Cr6+脅迫下，接種Exiguobacterium sp. S2玉米幼苗的各種生理指標(biāo)表明，在不同濃度Cr6+存在時(shí)都能促進(jìn)植物總體的增長(zhǎng);這項(xiàng)工作證明了存在重金屬Cr6+時(shí)引入微小桿菌能確保植物的生存，甚至保護(hù)它們;植物效應(yīng)與重金屬濃度、污染物的接觸時(shí)間、植物固有的抗性有關(guān)。當(dāng)存在微小桿菌時(shí)，能夠維持玉米幼苗根長(zhǎng)、葉面積、莖長(zhǎng)的生長(zhǎng)，對(duì)重金屬的耐受性試驗(yàn)表明這種植物與微小桿菌之間有協(xié)同作用，特別是Exiguobacterium sp. S2對(duì)污染物影響的回應(yīng)。微小桿菌就像分析的那樣，可以推薦用來(lái)增加植物的生物量，穩(wěn)定或修復(fù)重金屬污染的土壤。Exiguobacterium spp.分布廣泛，生存環(huán)境多樣，具有分解復(fù)雜有機(jī)污染物、轉(zhuǎn)化重金屬、促生作用等極具實(shí)用價(jià)值的功能。

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