影響白酒中氰化物檢測加標回收率因素探究及方法優(yōu)化

氰化物是酒類的一項重要食品安全指標。白酒中氰化物來源有很多種：如果白酒在釀造過程中使用了使用木薯和薯類植物為原料，根部外表大量氫氰酸會導致氰化物產生，釀酒過程中可能使用了受污染生產用水、使用含氰化物基酒或調味酒[1]、使用農藥污染的原料和釀酒過程中的變異反應[2]都有可能帶入氰化物污染，所以白酒氰化物超標時有發(fā)生。GB2757-2017中規(guī)定氰化物（以HCN計按100%酒精度折算）限量≤8.0mg/kg[3]。GB 5009.36-2016中第一法紫外分光光度法是白酒中氰化物檢測最常用的檢測方法，與被替代方法GB 5009.48-2003的4.7相比，新方法采用堿性條件下加熱除去高沸點有機物,然后在pH=7.0條件下,用氯胺T將氰化物轉變?yōu)槁然?再與異煙酸-吡唑啉酮作用,生成藍色染料,與標準系列比較定量的原理，主要優(yōu)化了檢測過程中部分樣品在顯色過程中由于高沸點有機物引起的顯色液渾濁問題，即GB 5009.36-2016中第一法的5.2.1步驟：“吸取1.0mL試樣于50mL燒杯中,加入5mL2g/L氫氧化鈉溶液,放置10min,然后放于120℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1mL,取下放至室溫,用2g/L氫氧化鈉溶液轉移至10mL具塞比色管中,最后加2g/L氫氧化鈉至5mL”[4][5]。但在實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)由于該步驟中對于“120℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1mL”最終剩余溶液體積沒有強調精確，所以在實際檢測過程中就會出現(xiàn)相同樣品在加熱后最終剩余溶液體積（相同加熱條件下通過加熱時長反映）不同引起檢測結果不一致的情況。同時在檢測中還發(fā)現(xiàn)嚴格按照該步驟操作，將溶液120℃電加熱板上加熱至溶液＜2ml時，大部分白酒樣品加標回收率都很低且不同白酒樣回收率差異較大。為探究檢測過程中對白酒中氰化物含量檢測影響因素，針對GB 5009.36-2016中第一法的5.2.1步驟進行相關探索實驗。

1.實驗方法與材料：

1.1 實驗材料：

1.1.1 試劑：蒸餾水，無水乙醇，冰醋酸，乙酸乙酯、氫氧化鈉系列溶液(18g/L，15g/L，12g/L，10g/L，5g/L，2g/L)，硼氫化鉀堿溶液（0.3g硼氫化鉀溶于100ml 2g/L氫氧化鈉溶液中），2g/L乙酸溶液(1+24)，酚酞-乙醇指示液(10g/L)，磷酸鹽緩沖溶液[(0.5mol/L)pH7.0]，異煙酸-吡唑啉酮溶液,氯胺T溶液(10g/L)，水中氰成分分析標準物質(50μg/mL)，氰離子標準中間液 (1μg/mL)。

1.1.2 儀器、器皿：雙光束紫外可見分光光度計（TU1900北京普析通用儀器有限責任公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司）,電加熱板(DB-3金壇市金城國盛實驗儀器廠)，千分之一電子天平(JY203上海浦春計量儀器有限公司)，50ml玻璃燒杯,10mL具塞比色管,25mL具塞比色管。

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1.1.3 樣品：

1.1.1.1 市售不同類型白酒

1.1.1.2 模擬白酒樣品：使用無水乙醇、蒸餾水、乙酸、乙酸乙酯配制的模擬白酒樣品

1.2 實驗方法：

1.2.1 檢測加熱時長對加標回收率的影響（反映最終加熱后剩余液體）

在相同的條件下，即加熱溫度、加熱板、被測樣品，全部一致的情況下，通過不同的加熱時長處理(20min,30min,40min,50min,60min,70min,80min)。實驗操作除了5.2.1步驟“于120℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1mL,”外，其余步驟按照GB 5009.36-2016中第一法操作。通過樣品加標回收實驗，檢測不同三種白酒樣品在不同加熱時長下樣品回收率。

1.2.2 檢測加入堿液濃度及標品添加濃度對加標回收率的影響

在相同的條件下，通過加入5ml不同濃度濃度氫氧化鈉溶液(2g/L,5g/L，10g/L,15g/L,18g/L)，即加熱溫度、加熱時長、加熱板、被測樣品全部一致的情況下，實驗操作除了5.2.1步驟“加入5mL2g/L 氫氧化鈉溶液”外，其余步驟按照GB 5009.36-2016中第一法操作。通過樣品加標回收實驗，檢測不同三種白酒樣品在相同加熱時長下樣品回收率。

在相同情況下，按照GB 5009.36-2016中第一法操作步驟，對三個白酒樣品添加不同量的標品，檢測樣品在標品不同添加濃度下的加標回收率，檢測標品添加濃度對加標回收率的影響。

1.2.3 樣品中總酸總酯及酒精度對加標回收率影響

在相同情況下，按照GB 5009.36-2016中第一法操作步驟，對模擬樣品1-12號進行樣品加標檢測，檢測相同酒精度樣品中總酸總酯對加標回收率影響及相同總酸總酯條件下乙醇與水的體積比（體現(xiàn)酒精度）對加標回收率影響。

1.2.4 對方法優(yōu)化后加標回收率的檢測

圖表1 不同加熱時長對加標回收率影響

通過提高氫氧化鈉濃度、縮短加熱時長、添加還原劑的方式對檢測方法進行優(yōu)化，檢測不同樣品的加標回收率，找到最合適的檢測方法。

2.檢測數(shù)據與結果分析：

2.1 檢測加熱時長對加標回收率的影響（反映加熱后剩余溶液體積）

通過圖表1實驗數(shù)據發(fā)現(xiàn)：除了白酒樣品3在加標濃度4mg/L時，由于整體回收率太低，導致檢測結果低看不出明顯趨勢；樣品1和樣品2回收率隨著加熱時長增加，其加標回收率呈下降趨勢。樣品3在將加標濃度增加到10mg/L后，隨加熱時長增加，其加標回收率也呈下降趨勢。即白酒樣品的加標回收率隨加熱剩余液體體積的減少而減少，當加熱時長達到80min時，剩余液體＜2ml才能保證達到GB 5009.36-2016中第一法的5.2.1步驟中“加熱至溶液剩余約1mL”，而此時大部分樣品加標回收率低于60%，部分樣品低于40%，通過縮短加熱時長確實可以提高樣品加標回收率，但是像樣品3這樣的白酒樣品，加熱時間低于30min會因為部分高沸點有機物（主要是醛類）揮發(fā)不徹底，導致后續(xù)步驟顯色過程出現(xiàn)渾濁，出現(xiàn)顯色偏淺，所以僅僅縮短加熱時長無法獲得滿意的加標回收率，這種變化趨勢在氰化物陽性樣品中也存在，實驗數(shù)據見圖表2。

圖表2 陽性樣品的氰化物含量隨加熱時長變化

2.2 檢測加入堿液濃度及標品添加濃度對加標回收率的影響

通過圖表3實驗數(shù)據可知，確實可以通過提高加入固定氰化物的堿液濃度減少加熱過程中氰化物損失來提高添加回收率，但是加入堿液到達一定濃度后可能影響到后續(xù)顯色，且對于下一步調節(jié)pH值帶來困難，所以大部分樣品在大約10g/L的氫氧化鈉濃度下具有最高添加回收率，再增加氫氧化鈉濃度后添加回收率反而會下降，且僅提高氫氧化鈉濃度不足以達到滿意的加標回收率。

圖表3 不同堿液濃度對加標回收率的影響

圖表4 不同加標濃度對加標回收率的影響

而根據圖表4實驗數(shù)據可知在檢測真實酒樣過程中，標品添加濃度越高的情況下，回收率越高。這就解釋了在檢測過程中相同的酒樣在不同的標品添加濃度下為何會造成添加回收率存在很大的差異，主要原因可能是不同濃度下氰化物損失速率不同造成的。

2.3 檢測樣品中酒精度及總酸總酯對加標回收率影響

通過圖表6實驗數(shù)據可知，對模擬樣品的加標回收率檢測，在相同的酒精度（乙醇水體積比體現(xiàn)）情況下，總酸、總酯含量越高，樣品加標回收率越低。可能原因是樣品中的總酸、總酯會消耗溶液中的氫氧化鈉，影響堿液中對氰化物的固定 。

圖表6 50%（V/V)乙醇模擬樣品在不同總酸、總酯濃度下加標回收率影響

圖表7 不同體積比乙醇模擬樣品在相同總酸、總酯濃度下加標回收率影響

通過圖表7實驗數(shù)據可知，對模擬樣品的加標回收率檢測，在總酸、總酯含量相同的情況下，乙醇水體積比（體現(xiàn)酒精度）越高，加標回收率越高。

2.4 對方法優(yōu)化后加標回收率檢測

通過上述實驗確定影響白酒中氰化物檢測影響因素很多，試驗中我們可控的因素只有兩種：即加熱時長（剩余溶液體積）和調節(jié)氫氧化鈉濃度，根據驗證數(shù)據，減少加熱時長和將氫氧化鈉調節(jié)到合適濃度，可以提高加標回收率，且單獨優(yōu)化一個因子無法保證所有樣品具有較高回收率。另外在實際操作中，按照GB 5009.36-2016中第一法的5.2.1步驟操作，在減少加熱時長同時，由于剩余溶液體積增加，導致后續(xù)步驟中最終定容體積會超過規(guī)定的10ml，所以優(yōu)化方法將步驟中各液體體積擴大一倍，定容體積增至25ml可解決這一問題（后通過實驗發(fā)現(xiàn)堿液體積為5ml對檢測結果也未有明顯影響）。另外，由于部分含醛類物質較多的白酒，加熱時長太短會造成后續(xù)顯色過程渾濁，導致顯色偏淺，結果偏低，加熱時長太長又會造成氰化物損失，通過實驗確認加入一定量的硼氫化鉀還原白酒中醛類物質可以解決在加熱時間較短時顯色渾濁問題。最終確定如下操作步驟可以保證大多數(shù)被測樣品加標回收率能在95%以上，所有被測樣品加標回收率在85%以上，具體操作步驟如下：

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（1）吸取2.0mL試樣于50mL 燒杯中,加入5mL 10g/L 氫氧化鈉溶液和0.3%硼氫化鉀100μl,放置10min,然后放于120℃電加熱板上加熱30min,取下放至室溫,用水轉移至25mL具塞比色管中,加水至10mL;

（2）用移液管分別吸取0mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL氰離子標準中間液置于25mL比色管中,加水至10mL。

（3）于試樣及標準管中分別加入2滴酚酞指示劑,然后加入乙酸溶液調至紅色褪去,再用2g/L氫氧化鈉溶液調至近紅色,然后加4mL磷酸鹽緩沖溶液 (如果室溫低于20 ℃即放入 25 ℃ ～30 ℃水浴中10min),再加入0.4mL氯胺T溶液,搖勻放置3min,加入4mL異煙酸-吡唑啉酮溶液,加水稀釋至刻度,加塞混合均勻,在37℃恒溫水浴鍋中放置40min,取出用1cm 比色杯以空白管調節(jié)零點,于波長638nm處測吸光度。

3.結論：

根據實驗，我們得出如下結論：按照GB 5009.36-2016 第一法檢測白酒氰化物過程中，之所以會出現(xiàn)樣品檢測結果不穩(wěn)定的原因是：該方法并未精確規(guī)定加熱剩余液體的體積，而加熱后剩余溶液體積的多少會對檢測結果有影響；之所以會出現(xiàn)加標回收率偏低且不穩(wěn)定的問題，主要是因為加熱后剩余溶液多少，樣品中標品添加濃度，酒樣中酒精度、總酸、總酯含量不一致都會對樣品加標回收率造成影響。究其原因主要是因為加入氫氧化鈉濃度過低，加熱時長過長導致加熱過程中出現(xiàn)氰化物損失。通過實驗可知，即使增加堿液濃度，也無法在加熱至溶液只剩約1ml的情況下保證有很好的加標回收率，說明堿液固定氰化物在長時間加熱時并不穩(wěn)定。而僅僅通過提高加入的堿液濃度或縮短加熱時長，也無法保證檢測結果穩(wěn)定，但如果通過同時提高加入的氫氧化鈉濃度和縮短加熱時長并加入強還原劑硼氫化鉀情況下，可以使絕大多數(shù)白酒樣品具有較高加標回收率且檢測結果穩(wěn)定。