中醫(yī)烙法對慢性扁桃體炎扁桃體組織中細(xì)胞因子表達(dá)影響的實驗研究

曲汝鵬 冷輝 孫海波

慢性扁桃體炎（Chronic tonsillitis，CT）是耳鼻咽喉科臨床常見的多發(fā)病，是由鏈球菌或葡萄球菌感染引起，或某些急性傳染性疾病反復(fù)發(fā)作或隱窩引流不暢，而致扁桃體隱窩及其實質(zhì)發(fā)生的慢性炎癥病變。以咽喉腫痛、發(fā)熱、扁桃體紅腫、化膿等為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性疾病[1]。截止目前國內(nèi)外對于本病的研究仍未能闡明其發(fā)生機(jī)制，近年來研究認(rèn)為IL-4介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在慢性扁桃體炎的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[2-5]。免疫球蛋白IgE是引起I型變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的主要抗體，健康人群的血清中IgE的含量極低，扁桃體中也無IgE表達(dá)。現(xiàn)有研究顯示，慢性扁桃體炎患者中，扁桃體組織表現(xiàn)為IgE和嗜酸細(xì)胞的浸潤，隱窩中網(wǎng)狀上皮及濾泡間區(qū)中含有大量的IL-4[2-5]，說明在慢性扁桃體炎患者存在一定的變態(tài)反應(yīng)，推測可能為IL-4活化扁桃體中B淋巴細(xì)胞合成IgE[6]激發(fā)的變態(tài)反應(yīng)有相關(guān)聯(lián)系。

中醫(yī)烙法作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)外治法的特色療法之一，不僅可保留扁桃體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，還可明顯提高了免疫球蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步提高了患者的機(jī)體免疫力[7，8]。

本研究在以往研究基礎(chǔ)上，深入對細(xì)胞因子在扁桃體組織中的表達(dá)變化進(jìn)行研究，探討細(xì)胞因子導(dǎo)致扁桃體致炎機(jī)理，并通過中醫(yī)烙法對目標(biāo)指標(biāo)表達(dá)的干預(yù)，推測中醫(yī)烙法的作用機(jī)制為抑制細(xì)胞因子表達(dá)實現(xiàn)消除慢性炎癥，提高患者的免疫力。

資料與方法

1 臨床資料

1.1 一般資料

本研究選取2017年5～10月期間在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科門診慢性扁桃體炎患者10例及住院因特發(fā)性扁桃體肥大接受手術(shù)治療的患者10例為研究對象。兩組性別、年齡、扁桃體大小等方面比較,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，且入組前2周內(nèi)無全身或局部炎癥，未應(yīng)用任何抗生素。本次研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并獲得患者家屬的知情同意，選擇能配合完成治療，依從性高的患者。見表1。

表1 兩組一般資料均衡性比較（±s）

表1 兩組一般資料均衡性比較（±s）

組別 例 性別 年齡（歲） 扁桃體大小男女烙治組 1 0 6 4 8.6±2.1 1 Ⅱ°對照組 1 0 5 5 6.3±1.4 9 Ⅱ°

1.2 慢性扁桃體炎診斷和納入標(biāo)準(zhǔn)

符合慢性扁桃體炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；年齡4～20歲；病程1年以上，急性扁桃體炎每年發(fā)作4～5次；查體見雙扁桃體Ⅱ°肥大，表面不光滑，雙側(cè)腭咽弓血管走形明顯，呈暗紅色，用力擠壓腭舌弓，可從扁桃體隱窩口內(nèi)溢出膿栓；本次只給予中醫(yī)烙法治療，未采用其他治療方法的患者。

1.3 慢性扁桃體炎排除標(biāo)準(zhǔn)

慢性扁桃體炎急性發(fā)作期患者；繼發(fā)引起腎小球腎炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、長期低熱、心肌炎等患者；嚴(yán)重心、肝、腎、造血系統(tǒng)疾病和精神病者；不同意單純中醫(yī)烙法治療的患者。

1.4 對照組納入標(biāo)準(zhǔn)

同期選擇住院接受扁桃體切除的特發(fā)性扁桃體肥大（Idiopathic Tonsillar Hypertrophy ITH）患者。選擇標(biāo)準(zhǔn)為患者扁桃體體積增大引起阻塞性睡眠呼吸暫停，既往無扁桃體感染史，查體見雙側(cè)扁桃體光滑，腭舌弓淡紅，隱窩口形態(tài)正常。

2 方法

2.1 設(shè)備及試劑

2.1.1 中醫(yī)烙法器械

烙鐵 [所采用的烙鐵為我院自行研制的平板圓形中號烙鐵（直徑 7mm，厚度 2～3mm）]3～4支，壓舌板，酒精燈，麻油，頭燈。

2.1.2 試劑

IL-4（貨號：SEA077Hu）、IL-5（貨號：SEA 078 Hu）、IL-10（貨號：SEA056Hu）、IFN-γ（貨號：SEA 049Hu）、TGF-β（貨號：SEA124Hu） 含量檢測試劑盒，購自武漢優(yōu)爾生生物科技股份有限公司。

2.1.3 主要儀器

BS223S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，奧地利安圖公司生產(chǎn)；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特生產(chǎn)；SANYO超低溫冰箱，日本SANYO公司生產(chǎn)。

2.2 取材方法

2.2.1 CT患者

2.2.1.1 治療前取材

患者未進(jìn)行中醫(yī)烙法治療前，1%利多卡因局麻下鉗取部分扁桃體上極組織，迅速放入液氮中冷凍，于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。作為治療前樣本?/p>

2.2.1.2 中醫(yī)烙法治療

醫(yī)生與患者面對面端坐，先將烙鐵在酒精燈外焰燒至通紅（約120℃），取一支烙鐵蘸上麻油（約0.5s），趁著在麻油瓶中冒煙時取出烙鐵，與壓舌板同時迅速地送進(jìn)口腔到咽部，對準(zhǔn)扁桃體施行燒烙，燒烙瞬間當(dāng)聽到局部發(fā)出“茲拉”聲音后（約0.5～1s）立即將烙鐵抽出，不宜停留。此為“一鐵”治療量。更換烙鐵，同法反復(fù)燒烙。將扁桃體表面烙成一片黑褐色烙痂為宜，一次治療量約每側(cè)扁桃體燒烙10～15“鐵”。一次治療結(jié)束后，每間隔2日再次行中醫(yī)烙法治療，共計烙治5次，完成中醫(yī)烙法治療。

2.2.1.3 治療后取材

患者完成所有中醫(yī)烙法治療后，以同樣方法鉗取部分扁桃體上極組織作為治療后樣本。

2.2.2 ITH患者

患者均于全麻下行雙側(cè)腭扁桃體切除術(shù)，生理鹽水漂洗清潔后，切除部分扁桃體上極組織作為對照組樣本，處理方式同CT患者標(biāo)本組織。

2.3 分組

2.3.1 對照組

取材于ITH患者的扁桃體組織作為對照組。

2.3.2 烙治組

取材于CT患者的扁桃體組織作為實驗組，其中取材于首次中醫(yī)烙法治療前的扁桃體組織作為烙治前；取材于末次中醫(yī)烙法治療后的扁桃體組織作為烙治后。

2.4 指標(biāo)檢測

使用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組扁桃體組織中 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TGF-β 含量，步驟如下：

①取新鮮扁桃體組織100mg，剪碎放入2ml離心管中，加入預(yù)冷的，含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液1ml，高速勻漿機(jī)制備組織勻漿液，2000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液，檢測細(xì)胞因子濃度。

②將試劑盒從冰箱中取出，在室溫環(huán)境中平衡1小時，達(dá)到室溫后繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)檢測。

③取出標(biāo)準(zhǔn)品，自備離心管7支，分別編號1～7，于1號管以外的6支離心管中均加入100ul標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，然后將標(biāo)準(zhǔn)品200ul加入1號管，按照倍比稀釋的方法，對標(biāo)準(zhǔn)品原液進(jìn)行稀釋。即從1號管中吸取100ul液體，加入2號管，充分吹打后，從2號管中吸取100ul液體，加入3號管，充分吹打后，從3號管中吸取100ul液體，加入4號管，直至稀釋到7號管。

④在酶標(biāo)板中設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔，樣品孔和空白孔，按照預(yù)先設(shè)定的孔加入相應(yīng)試劑或樣品。標(biāo)準(zhǔn)品孔加入上步驟中稀釋的1～7號標(biāo)準(zhǔn)品，50ul/孔。樣品孔加入各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，50ul/孔?？瞻卓撞患尤肴魏卧噭?。加樣完畢，將酶標(biāo)板在水平桌面輕輕震蕩30秒，封板膜封板后，37℃恒溫水浴振蕩器中孵育2小時。

⑤取出酶標(biāo)板，揭掉封板膜，棄掉板孔中液體，并于濾紙上拍干，每孔中加入洗滌液250ul，輕輕震蕩后，浸泡1分鐘后倒掉洗滌液，并再次于濾紙上拍干，如此反復(fù)3次。

⑥除空白孔外，其余各孔均加入酶標(biāo)試劑，50ul/孔，輕輕震蕩后，封板膜封板，37℃恒溫水浴振蕩器中孵育1小時。

⑦取出酶標(biāo)板，揭掉封板膜，棄掉板孔中液體，并于濾紙上拍干，每孔中加入洗滌液250ul，輕輕震蕩后，浸泡1分鐘后倒掉洗滌液，并再次于濾紙上拍干，如此反復(fù)3次。

⑧所有板孔均加入顯色液A和顯色液B，A、B均為50ul/孔，輕輕震蕩后，封板膜封板，37℃恒溫水浴振蕩器中孵育15分鐘。

⑨取出酶標(biāo)板，切勿倒掉板孔中液體，直接向各孔中加入50ul終止液，輕輕震蕩30秒，于酶標(biāo)儀中讀取各孔吸光度值。

⑩按照標(biāo)準(zhǔn)品孔OD值和相應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合標(biāo)準(zhǔn)方程，將樣品孔OD值代入方程，計算樣品孔中細(xì)胞因子濃度，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件處理。整理、核對數(shù)據(jù)，所得實驗計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，首先檢查方差的齊性檢驗，然后采用完全隨機(jī)設(shè)計方差分析(One-way ANOVA法)，組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 扁桃體組織IFN-γ、TGF-β含量測定

扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量檢測結(jié)果顯示：與對照組（ITH患者）比較，實驗組（CT患者）扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與烙前比較，烙后扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2，見圖 1。

表2 各組扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量（±s）

表2 各組扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與烙前組比較。

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圖1 各組扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量水平柱狀圖

圖1 ELISA法檢測IFN-γ、TGF-β含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 扁桃體組織IL-4、IL-5、IL-10含量測定

扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10含量檢測結(jié)果顯示：與對照組（ITH患者）比較，烙前組（CT患者）扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與烙前組比較，烙后組扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3，圖 2。

表3 各組扁桃體組織中 IL-4、IL-5、IL-10 含量（±s）

表3 各組扁桃體組織中 IL-4、IL-5、IL-10 含量（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與烙前組比較。

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圖2 各組扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10含量水平柱狀圖

圖2 ELISA法檢測IL-4、IL-5、IL-10含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

討論

1 免疫因素對慢性扁桃體炎發(fā)病機(jī)制的影響。

慢性扁桃體炎是耳鼻咽喉科臨床常見的多發(fā)疾病，多由扁桃體急性炎癥反復(fù)刺激或因扁桃體隱窩內(nèi)細(xì)菌等抗原物質(zhì)寄存，引流不通暢，而致扁桃體隱窩及其實質(zhì)發(fā)生慢性炎癥病變。還可以繼發(fā)于周邊器官和全身感染之后。截止目前國內(nèi)外對于本病的研究仍未能闡明其發(fā)生機(jī)制，感染致病因素已達(dá)成共識，近年來研究認(rèn)為本病與自身免疫反應(yīng)有一定相關(guān)性。

腭扁桃體是人體機(jī)體免疫防御的重要免疫器官之一，位于上呼吸道的“咽喉要道”，是抵御呼吸道感染的第一道防線[10]。此防線依靠扁桃體通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體的基本功能來實現(xiàn)的。再者，咽部淋巴組織豐富構(gòu)成咽淋巴環(huán)結(jié)構(gòu)，以腭扁桃體為主要代表發(fā)揮免疫功能。

慢性扁桃體炎患者扁桃體細(xì)胞免疫功能受到一定的抑制導(dǎo)致免疫失衡，扁桃體抵抗致病菌的能力因此下降，致病菌侵入扁桃體實質(zhì)后開始大量繁殖，產(chǎn)生大量毒素侵蝕破壞扁桃體的隱窩上皮組織，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

IFN-γ主要由活化的Th細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。其生物學(xué)功能主要是免疫調(diào)節(jié),誘導(dǎo)多種抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHC-I/II分子,活化單核、巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)其溶菌活性及分泌IL-1,6,8,TNF-a等，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

TGF-β可由機(jī)體多種細(xì)胞分泌，一般處于非活性狀態(tài)。在體外，非活性狀態(tài)的TGF-β又稱為latency associated peptide（LAP），通過酸處理后被活化。在體內(nèi)，酸性環(huán)境一般存在于骨折附近和正在愈合的傷口。蛋白質(zhì)的裂解作用可使TGF-β復(fù)合體變?yōu)榛罨腡GF-β。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β對細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。張蕊等[11]的研究表明，SPF雛雞感染IBDV后,其哈德爾腺和盲腸扁桃體中TGF-β1 mRNA表達(dá)水平顯著升高。提示TGF-β參與了該炎癥反應(yīng)過程。

IL-4主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生。其生物學(xué)作用為促使抗原或絲裂原活化的B細(xì)胞分裂增殖；促進(jìn)T細(xì)胞的活性；IL-4不能刺激巨噬細(xì)胞增殖，但可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能；IL-4與IL-3協(xié)同可維持和促進(jìn)肥大細(xì)胞的增殖，在某些超敏反應(yīng)性疾病發(fā)生中具有一定的意義。有報道顯示，IL-4在慢性扁桃體炎的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的免疫促進(jìn)或免疫抑制作用,影響慢性扁桃體炎炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[12]。

IL-5由抗原活化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生；肥大細(xì)胞也能產(chǎn)生IL-5。其主要功能是參與炎癥反應(yīng)，刺激嗜酸性粒細(xì)胞增殖、分化及活化。IL-5不僅使嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量增加，而且能增強(qiáng)其功能。在蠕蟲感染和過敏性疾病時出現(xiàn)的嗜酸性粒細(xì)胞增多主要是由IL-5引起的。人類IL-5還能促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺和白三烯等[13]炎癥介質(zhì)，從而提高嗜堿性粒細(xì)胞的活性。楊珍的研究表明，慢性扁桃體炎的扁桃體組織中IL-4和IL-5均高表達(dá),且主要分布于扁桃體的免疫功能區(qū),從而證明變態(tài)反應(yīng)的存在為扁桃體反復(fù)發(fā)炎的病因之一。

IL-10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子。幾乎所有淋巴細(xì)胞均能合成IL-10。生物學(xué)功能主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是目前公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子。在腫瘤、感染、器官移植、造血系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，免疫功能失調(diào)和感染二者在慢性扁桃體炎發(fā)病中相互作用，感染可引起免疫功能下降，進(jìn)而又是出現(xiàn)反復(fù)感染的原因之一。因此，我們認(rèn)為，慢性扁桃體炎患者扁桃體組織中高表達(dá)的IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-5、IL-10 是慢性扁桃體炎癥反復(fù)發(fā)作原因之一。

2 中醫(yī)烙法對慢性扁桃體炎 IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-5、IL-10細(xì)胞因子的影響

中醫(yī)烙法治療慢性扁桃體炎的記載，最早可追溯到唐代孫思邈的《千金翼方》；明代陳實功的《外科正宗》明確地記載了應(yīng)用“針烙”的方法治療乳蛾；清代《咽喉經(jīng)驗秘傳》中有烙法治療乳蛾的記載；清代金德鑒《焦氏喉科枕秘》中具體記載了烙鐵的質(zhì)地、形狀及施烙方法、注意事項。近年來，隨著免疫研究的不斷深入，對于過早切除扁桃體組織存在爭議[14]。眾所周知，扁桃體為咽喉部最大的淋巴組織，擔(dān)負(fù)著上下呼吸道的防御功能，能夠產(chǎn)生免疫功能很強(qiáng)的免疫球蛋白IgA，抑制細(xì)菌對呼吸道黏膜的粘附，抑制細(xì)菌的生長和擴(kuò)散。報道顯示，扁桃體摘除術(shù)后，機(jī)體出現(xiàn)呼吸道抗感染功能下降，免疫監(jiān)視功能障礙等成為大概率事件。而中醫(yī)烙法的發(fā)揚光大，使得慢性扁桃體炎的治療實現(xiàn)了“兩全”，既解決炎癥的反復(fù)發(fā)作，又保留了扁桃體。隨著科學(xué)技術(shù)的革新，本科室在孫海波教授、冷輝教授的不斷深入研究下，簡化了中醫(yī)烙法的操作流程，規(guī)范烙具，避免副反應(yīng)發(fā)生，形成簡單易行、便于臨床推廣的治療規(guī)范[15]。課題組多年來的臨床實踐表明[16-21]，中醫(yī)烙法通過燒烙刺激后，患者血清IgG、IgA、IgM濃度較烙治前明顯升高，且接近正常人水平，說明殘留扁桃體仍可發(fā)揮其體液免疫作用，中醫(yī)烙法可保留扁桃體的免疫功能；中醫(yī)烙法提高了扁桃體的hBD-2的表達(dá)水平，且可能維持相當(dāng)長的一段時間，從而達(dá)到治療的目的。中醫(yī)烙法對于慢性扁桃體炎臨床有效率達(dá)94.55%，一年復(fù)發(fā)率僅為3.03%[15，20]。多年的臨床應(yīng)用和療效觀察告訴我們，中醫(yī)烙法不但可以保存扁桃體組織，消除慢性炎癥和臨床癥狀，還可提升患者的機(jī)體免疫能力，許多無法手術(shù)的患者也可得到中醫(yī)烙法治療。

我們前期研究[7，8]從烙治后免疫學(xué)和組織學(xué)觀察，證實中醫(yī)烙法對機(jī)體免疫力和扁桃體組織學(xué)的影響。本次實驗結(jié)果顯示：通過烙前組與對照組的IFN-γ、TGF-β比較發(fā)現(xiàn)，CT患者扁桃體組織中的IFN-γ、TGF-β含量顯著高于對照組，提示CT發(fā)生時，扁桃體局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，以IFN-γ、TGF-β高表達(dá)為主要表現(xiàn)。通過中醫(yī)烙法治療，烙后組患者扁桃體組織中IFN-γ、TGF-β含量均顯著下降，說明中醫(yī)烙法對IFN-γ、TGF-β具有抑制作用，而中醫(yī)烙法的抗炎作用可能就是通過抑制IFN-γ、TGF-β的分泌實現(xiàn)的；通過對照組與烙前組IL-4、IL-5、IL-10含量比較，CT患者扁桃體組織中的IL-4、IL-5、IL-10 含量顯著高于對照組，提示 IL-4、IL-5、IL-10的高表達(dá)是慢性扁桃體炎炎癥反應(yīng)的發(fā)生之一。與烙前組比較，烙后組扁桃體組織中IL-4、IL-5、IL-10的含量均顯著降低，說明中醫(yī)烙法對IL-4、IL-5、IL-10的合成與分泌具有一定的抑制作用。

綜上所述，慢性扁桃體炎發(fā)生時，扁桃體組織局部 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TGF-β 等細(xì)胞因子的高表達(dá)狀態(tài)是導(dǎo)致其局部炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵因素，介導(dǎo)了局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生；中醫(yī)烙法可能是由于“熱”刺激改變扁桃體局部微環(huán)境，抑制扁桃體局部組織中 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TGF-β 的合成與分泌，從而對慢性扁桃體炎產(chǎn)生抗炎作用。但中醫(yī)烙法通過何種途徑實現(xiàn)抑制IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TGF-β的合成與分泌尚需進(jìn)一步研究。