不同工藝的絞股藍總甙降血脂作用的對比研究＊

匡艷輝，張偲偲，朱晶晶，王德勤，王智民，覃仁安，李楚源

（1.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510515；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

絞股藍Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino隸屬于葫蘆科絞股藍屬，多年生草質(zhì)藤本植物，味苦，性寒，無毒，且含有比較豐富的絞股藍皂苷、多糖、黃酮及人體必需的8種氨基酸和多種微量元素等成分。其主要化學(xué)成分是皂苷類，具有抗高脂血癥、抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用，因含有人參皂苷故又稱為“南方人參”和“第二人參”[1-4]。藥材經(jīng)過提取分離、純化精制、制劑后得到的絞股藍總甙片，具有養(yǎng)心健脾，益氣活血，除痰化瘀，降血脂等功效，尤其在降血脂方面療效優(yōu)異，具有很好的市場前景[5,6]。

隨著CFDA 對中藥提取物政策的放開和加強監(jiān)管，企業(yè)可以自制提取物以滿足制劑的需求[7]。絞股藍總甙主含達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷，這種皂苷具有熱不穩(wěn)定性，有許多絞股藍皂苷在水浴加熱時易形成C-20 位去糖基的次生苷、苷元和次級苷元等。因此，不同制備工藝對絞股藍皂苷的種類、含量和組成比例影響較大，有可能直接影響其藥效[8-11]。

由于絞股藍總甙提取物工藝1 僅經(jīng)過提取、分離及干燥所得，而工藝2 通過前期的工藝優(yōu)化后加入了純化步驟，并采用更加先進的干燥技術(shù)，所以在總皂苷含量方面，優(yōu)化后的工藝2的要比工藝1的高。在此基礎(chǔ)上，本項目擬以活性為導(dǎo)向來評價不同絞股藍總皂苷制備工藝，通過飼喂高脂高膽固醇飼料，建立大鼠高脂血癥模型，觀察工藝優(yōu)化前后的絞股藍總甙對高脂血癥的保護作用[12-15]，為絞股藍總甙后續(xù)的工藝優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

絞股藍總甙工藝1 提取物（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號：1706001），絞股藍總甙工藝2 提取物（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，批號：M170603），烏來糖（室溫保存，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20120316），0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20150806），阿托伐他汀鈣片（北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號：161119）。

1.2 儀器

DY89-Ⅱ型電動勻漿機；德國SIGMA3-18K 低溫高速離心機；美國BioTek ELx800 酶標(biāo)儀；日本日立7100 全自動生化分析儀；病理圖像分析系統(tǒng)，包括OLYMPUS BX41 顯微鏡（日本）和DP71+IPP6.0圖像采集系統(tǒng)；IPP6.0圖像采集系統(tǒng)。

1.3 動物

SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20g），湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2013-0004。

2 方法和結(jié)果

2.1 藥效指標(biāo)測定、樣品采集及統(tǒng)計分析方法

取90 只SD 大鼠，隨機分為9 組，每組10 只，在絞股藍各劑量組中，低、中、高劑量組分別為0.016、0.032和0.064 mg·kg-1·d-1，（按體重-體表面積轉(zhuǎn)換折算，約相當(dāng)于成人臨床日服用生藥量180 mg的1、2和4倍），具體分組及各組別劑量設(shè)置情況（表1）。除正常對照組飼喂正常飼料外，其余各組分別飼喂含有1.2%膽固醇的高脂飼料（52.2%基礎(chǔ)飼料+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉+蔗糖20%+豬油15%+酪蛋白10%+磷酸氫鈣0.6%+石粉0.4%+預(yù)混料0.4%）33 天。高脂血癥模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：與正常對照組相比，模型組血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白高密度脂蛋白膽固醇（LDLC）四項指標(biāo)中有兩項的水平顯著升高。在造模的同時，各組大鼠于每日上午灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)給藥33天。

表1 組別、劑量設(shè)計一覽表

具體觀察和檢查包括一般狀況觀察、體重、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平、血清游離脂肪酸（FFA）、肝組織超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平等指標(biāo)，具體測定方法如下：

血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平：于試驗期第12天對每組的5 只大鼠進行眼眶靜脈叢采血；末次給藥后，全部動物用烏來糖麻醉后，腹主動脈取血；兩次的血樣經(jīng)室溫靜置2 h后，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清。采用日立7100全自動生化儀檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平。

血清FFA：末次給藥后，全部動物用烏來糖麻醉后，腹主動脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清。血清中按照FFA試劑盒說明書測定。

SOD、還原型GSH和MDA水平：末次給藥后，處死大鼠，置于-80℃冰箱保存。每組取5只大鼠的肝組織用生理鹽水按重量體積比（1∶9）制備組織勻漿液， 3 000 r·min-1 離心10 min，吸取上清。分別按照SOD、GSH和MDA試劑盒說明書測定上清SOD、還原型GSH和MDA含量。

ALT和AST水平：末次給藥后，全部動物用烏來糖麻醉后，腹主動脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清。采用日立7100 全自動生化儀檢測血清ALT、AST的水平。

統(tǒng)計分析方法：所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以（xˉ±s）的形式表示，各實驗組進行組間比較之前先進行組間方差分析（F 檢驗），當(dāng)組間方差齊同時，組間比較采用Student-T 檢驗（非配對的t 檢驗）進行統(tǒng)計，組間方差不齊時，采用校正的Student-T檢驗進行統(tǒng)計分析，當(dāng)P ＜0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)差異，P ＞0.05認為不具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 一般狀態(tài)觀察

試驗期間，各組動物進食、飲水、排泄、一般狀況均未見明顯異常。

2.3 體質(zhì)量

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對照組相比，模型組大鼠體重明顯升高。與模型組相比，給藥33天后各給藥組大鼠的體重未見明顯差異，表明絞股藍總甙提取物對模型大鼠的體重沒有影響（表2，表3）。

表2 絞股藍總甙提取物對高脂血癥雄性大鼠體重的影響（±s,n=5）

注：與正常對照組比較，#P ＜0.05。

組別劑量（/g·kg-1）第一周第二周體質(zhì)量/g第三周第四周正常對照組— 265.2±10.8 299.4±15.1 353.2±26.7 374.2±30.2模型組—296.2±12.2#336.8±20.2#392.8±21.8#426.0±18.6#工藝1低劑量組0.016 292.2±16.3 338.6±17.0 402.6±24.1 439.6±26.6工藝1中劑量組0.032 286.0±17.4 317.4±25.0 368.0±27.1 400.8±26.1工藝1高劑量組0.064 306.4±18.5 342.8±25.3 401.0±32.0 432.2±32.3工藝2低劑量組0.016 298.6±12.2 338.6±13.2 394.2±14.1 413.0±14.9工藝2中劑量組0.032 290.8±17.7 334.4±15.9 403.2±17.5 439.2±21.6工藝2高劑量組0.064 296.6±21.7 338.4±34.9 402.6±43.7 435.8±49.8阿托伐他汀鈣組0.005 297.8±15.1 337.0±17.1 395.8±22.2 424.4±26.8

2.4 血清TC和TG含量

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對照組相比，模型組大鼠血清TC含量明顯升高，連續(xù)33天給予阿托伐他汀鈣（5 mg·kg-1）后模型大鼠血清TC 含量明顯降低。說明模型建立成功。12天后模型組大鼠血清TG含量平均為4.15 mmol·L-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而33天后，模型組大鼠血清TG含量平均為0.56 mmol·L-1，與正常對照組相比未見明顯差異。

與模型組相比，工藝1 高劑量組，工藝2 高劑量組大鼠血清TC 含量能顯著降低模型大鼠血清TC 含量，其余劑量組與模型組相比未見明顯差異。

給藥12 天及33 天后，各給藥組大鼠血清TG 含量與模型組相比均未見明顯差異（P ＞0.05）。具體數(shù)值（表4）。

2.5 血清LDL-C、HDL-C和FFA含量

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對照組相比，模型組大鼠血清LDL-C 含量明顯升高，HDL-C 含量明顯降低，F(xiàn)FA 含量明顯升高；連續(xù)33 天給予阿托伐他汀鈣（5 mg·kg-1）后模型大鼠血清LDL-C 含量明顯降低，F(xiàn)FA含量明顯降低。說明模型建立成功。

與模型組相比，工藝1 高劑量組、工藝2 中劑量組及高劑量組能顯著降低LDL-C 含量。其余劑量組未見明顯差異。而各給藥組大鼠血清HDL-C 含量與模型組相比未見明顯差異。工藝1高劑量組、工藝2高劑量組能顯著降低模型大鼠血清FFA 含量。其余劑量組未見明顯差異。具體數(shù)值（表5）。

表3 絞股藍總甙提取物對高脂血癥雌性大鼠體重的影響（±s,n=5）

表3 絞股藍總甙提取物對高脂血癥雌性大鼠體重的影響（±s,n=5）

注：與正常對照組比較，#P ＜0.05。

組別劑量（/g·kg-1）第一周第二周體質(zhì)量/g第三周第四周正常對照組— 213.0±15.6 220.0±12.8 237.6±15.0 253.6±19.5模型組—229.8±11.9 246.6±17.3#269.0±17.5#282.8±19.1#工藝1低劑量組0.016 228.4±7.6 243.0±9.6 253.0±15.1 272.6±11.9工藝1中劑量組0.032 227.8±7.7 240.4±18.3 274.2±17.3 286.6±20.8工藝1高劑量組0.064 214.4±8.7 230.0±9.8 254.4±10.3 269.6±12.8工藝2低劑量組0.016 231.6±14.4 243.2±19.8 271.2±22.6 276.0±25.6工藝2中劑量組0.032 226.4±7.7 242.2±15.0 273.4±10.6 283.0±18.9工藝2高劑量組0.064 224.4±7.6 249.4±13.6 276.4±15.1 272.2±41.8阿托伐他汀鈣組0.005 220.6±11.2 238.6±7.2 263.4±13.7 276.0±16.0

表4 絞股藍總甙提取物對模型大鼠血清總膽固醇（TC）及血清甘油三酯（TG）的影響（±s,n=9-10）

表4 絞股藍總甙提取物對模型大鼠血清總膽固醇（TC）及血清甘油三酯（TG）的影響（±s,n=9-10）

組別劑量（/g·kg-1）動物數(shù)/只TC（/mmol·L-1）TG（/第m1m2o天l·L-1）TG（/第m3m3o天l·L-1）正常對照組— 10 1.64±0.27 1.53±0.63 0.80±0.26模型組—10 4.90±2.41#4.15±1.06#0.56±0.31工藝1低劑量組0.016 9 3.97±2.38 3.57±0.61 0.58±0.17工藝1中劑量組0.032 10 3.11±2.46 3.63±0.69 0.56±0.27工藝1高劑量組0.064 10 2.89±1.56*4.67±1.71 0.51±0.21工藝2低劑量組0.016 10 3.21±1.36 6.05±0.96 0.57±0.16工藝2中劑量組0.032 10 3.24±1.78 2.79±0.92 0.50±0.20工藝2高劑量組0.064 9 2.91±1.54*4.86±1.55 0.68±0.33阿托伐他汀鈣組0.005 9 2.86±1.11*5.47±1.57 0.49±0.08

注：TG 第12 天檢測動物數(shù)為5 只，第33 天檢測動物數(shù)為9-10 只。與正常對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。

2.6 肝組織超氧化物歧化酶活力SOD、還原型谷胱甘肽GSH和肝丙二醛MDA

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織SOD水平及還原型GSH含量明顯降低，MDA 含量明顯升高；連續(xù)33 天給予阿托伐他汀鈣（5 mg·kg-1）后模型大鼠肝組織SOD水平及還原型GSH含量明顯升高，MDA含量明顯降低。說明模型建立成功。

與模型組相比，工藝1 高劑量組、工藝2 中劑量組及高劑量能顯著升高模型大鼠肝組織SOD水平、還原型GSH含量，工藝1高劑量組、工藝2高劑量組能顯著降低MDA 含量。其余劑量組未見明顯差異。具體數(shù)值（表6）。

表5 絞股藍總甙提取物對高脂血癥大鼠血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的影響（±s,n=9-10）

表5 絞股藍總甙提取物對高脂血癥大鼠血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的影響（±s,n=9-10）

注：與正常對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。

組別劑量（/g·kg-1）動物數(shù)/只LDL-C（/mmol·L-1）動物數(shù)/只HDL-C（/mmol·L-1）動物數(shù)/只FFA（/μmol·L-1）正常對照組--10 0.23±0.10 10 0.59±0.08 9 912.9±163.9模型組--10 1.16±0.58#10 0.27±0.10#9 1368.6±121.9#工藝1低劑量組0.016 9 0.94±0.66 10 0.31±0.09 9 1317.4±110.9工藝1中劑量組0.032 9 0.75±0.54 10 0.34±0.16 9 1116.3±129.6工藝1高劑量組0.064 10 0.59±0.35*10 0.25±0.07 9 1098.7±123.7*工藝2低劑量組0.016 10 0.73±0.38 10 0.32±0.13 9 1313.1±88.9工藝2中劑量組0.032 9 0.63±0.44*10 0.29±0.09 9 1101.9±155.4工藝2高劑量組0.064 9 0.66±0.34*9 0.32±0.14 9 1016.8±142.0*阿托伐他汀鈣組0.005 9 0.62±0.26*10 0.26±0.10 9 842.0±108.4*

2.7 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對照組相比，模型組大鼠血清ALT 和AST 水平未見顯著差異。提示本實驗的動物模型未表現(xiàn)出明顯的肝損傷。

與模型組相比，給藥33 天后各給藥組大鼠血清ALT和AST水平未見明顯差異。具體數(shù)值（表7）。

3 討論

本研究采用的高脂血癥模型是用于評價或篩選降血脂藥物常用的模型，通過飼喂高脂高膽固醇飼料，使大鼠的脂質(zhì)代謝發(fā)生異常，表現(xiàn)為血清TC 和LDL-C的含量升高，HDL-C 的含量降低[16,17]。這種模型更接近于人類高脂血癥的發(fā)病過程，并且條件溫和、重復(fù)性好。同時，文獻資料證明，降低血脂有多種途徑，其中一種就是通過清除體內(nèi)自由基，減少細胞膜的脂質(zhì)過

注：與正常對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。

表7 絞股藍總甙提取物對高脂血癥大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響（±s,n=9-10）

表7 絞股藍總甙提取物對高脂血癥大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響（±s,n=9-10）

組別劑量（/g·kg-1）動物數(shù)/只ALT（/U·L-1）AST（/U·L-1）正常對照組— 10 28.2±10.8 107.7±33.5模型組—10 38.8±25.6 124.8±35.1工藝1低劑量組0.016 10 46.4±34.5 140.9±58.9工藝1中劑量組0.032 9 56.9±47.3 172.3±88.6工藝1高劑量組0.064 10 43.9±28.4 107.6±14.9工藝2低劑量組0.016 10 42.9±40.9 144.2±75.7工藝2中劑量組0.032 10 34.3±32.9 129.0±88.2工藝2高劑量組0.064 9 47.9±46.9 166.2±99.3阿托伐他汀鈣組0.005 10 40.2±25.2 115.8±41.4

表6 絞股藍總甙提取物對高脂血癥大鼠肝組織SOD、GSH及MDA水平的影響（±s,n=5）氧化而達到降血脂的目的。而絞股藍總皂甙可以顯著提高機體SOD、GSH 的活性，抑制MDA 的產(chǎn)生和/或加快其清除，從而有效的防治機體的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，能改變機體脂代謝的紊亂，調(diào)適機體的脂蛋白[18]。所以本研究同時檢測TC、TG 和LDL-C、SOD、GSH 和MDA等指標(biāo)，評價絞股藍總甙的降血脂作用。

通過結(jié)果可知絞股藍總甙提取物工藝1高劑量連續(xù)33 天給藥可降低模型大鼠血清TC、FFA、LDL-C 水平和肝臟MDA 含量，升高肝臟還原型GSH 的水平和SOD 的水平。工藝1 中、低劑量連續(xù)給藥33 天未表現(xiàn)出明顯的降血脂作用。而絞股藍總甙提取物工藝2高劑量連續(xù)33 天給藥也可降低模型大鼠血清TC、FFA、LDL-C 水平和肝臟MDA 含量，升高肝臟還原型GSH的水平和SOD的水平。工藝2中劑量也可降低模型大鼠血清LDL-C 水平，升高肝臟還原型GSH 的水平和SOD的水平?？芍獌煞N工藝的絞股藍總甙都有降低血脂的作用，工藝2 的藥效要略優(yōu)于工藝1，這為絞股藍總甙的工藝優(yōu)化提供科學(xué)基礎(chǔ)，下一步將開展絞股藍皂甙代謝組學(xué)的相關(guān)研究，找出其差異性的代謝物，揭示絞股藍總甙降血脂的作用機制。

本研究提示，由于絞股藍中含有的皂苷種類數(shù)量眾多，不同制備工藝方法對絞股藍皂苷的種類、含量和組成比例影響較大，而這也直接影響其藥效。為保證絞股藍總甙能更好的發(fā)揮功效，確保人們用藥安全、有效、穩(wěn)定可靠，有必要從藥理藥效方面著手，制定其工藝優(yōu)化方案。