梔子藥材的質(zhì)量表征與產(chǎn)地的關(guān)聯(lián)性研究＊

田瑞華，彭 平，劉 希，易劍平，張 蓓，遲玉明，陳加富

（1.中國(guó)北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司 北京 100079；2.北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司 北京100079；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 102446；4.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司 北京 100079）

梔子，為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效[1]，根據(jù)梔子本草考證，梔子藥材的道地產(chǎn)區(qū)為江西清江、湖北江陵、福建建甌，素有“皮薄而圓，小核”為優(yōu)質(zhì)的描述[2]，目前市場(chǎng)流通主要有江西、福建產(chǎn)區(qū)梔子藥材，梔子藥材中常有“水梔子”藥材為易混品種?，F(xiàn)有外觀性狀鑒別可對(duì)江西產(chǎn)區(qū)、福建產(chǎn)區(qū)、水梔子進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)區(qū)分，但外觀性狀常有變化，各產(chǎn)區(qū)梔子藥材及其與易混品“水梔子”的內(nèi)在化學(xué)質(zhì)量表征差異尚不明確[3-5]。

2015 版《中國(guó)藥典》對(duì)梔子藥材質(zhì)量控制以環(huán)烯醚萜苷梔子苷含量為指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，不能單以梔子苷含量作為為梔子藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[6,7]。有文獻(xiàn)對(duì)梔子藥材果型、外觀顏色、不同產(chǎn)地加工等差異對(duì)梔子藥材質(zhì)量進(jìn)行研究，采用HPLC指紋圖譜、UPLC指紋圖譜、多指標(biāo)成分含量測(cè)定等方法比較了梔子藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)[8-13]，發(fā)現(xiàn)梔子藥材等級(jí)與西紅花苷成分含量密切相關(guān)[5,6]，不同種植產(chǎn)區(qū)梔子藥材中綠原酸成分含量差異較大[14]，但未對(duì)梔子藥材中三大類成分：環(huán)烯醚萜苷類、酚酸類、二萜苷類，同時(shí)展開進(jìn)行整體質(zhì)量分析研究；付小海等人采用HPLC-EIS-MS 指紋圖譜對(duì)梔子、水梔子、大紅梔子進(jìn)行了差異分類，但未排除梔子藥材不同產(chǎn)區(qū)質(zhì)量差異[15]。本文基于前期研究基礎(chǔ)，采用HPLC 特征圖譜分析方法，對(duì)40 批次不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材，及其易混品“水梔子”同時(shí)進(jìn)行整體質(zhì)量分析，探究不同梔子藥材質(zhì)量表征差異，為梔子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

儀器：Waters e2695-2998PDA detector（沃特世科技（上海）有限公司），電子天平（型號(hào)：XP205，生產(chǎn)廠家：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司（十萬(wàn)分之一）），電子天平（型號(hào)：ML203，生產(chǎn)廠家：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司（萬(wàn)分之一）），超聲波清洗器（KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器有限公司）。

試藥：乙腈（默克公司，色譜純），無(wú)水甲酸（分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），超純水（milli-Q 超純水儀）。對(duì)照品：綠原酸（批號(hào)：110753-201716，純度：99.3%）、梔子苷（批號(hào)：110749-201718，純度：97.6%）購(gòu)自國(guó)家食品藥品檢定研究院、京尼平龍膽雙糖苷（批號(hào)：ZM0507BA14，純度：≥98%）、西紅花苷Ⅰ（批號(hào)：PO4M8F30582，純度：≥98%）、西紅花苷Ⅱ（批號(hào)：P23M8F36647，純度：≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 藥材信息

通過(guò)產(chǎn)地收集和藥材市場(chǎng)購(gòu)買，一共收集了40批次梔子藥材樣品，主要來(lái)源于福建、江西，其中包括3批水梔子樣品（表1）。其中批次s7-s14批次梔子藥材為2018年9月采摘，為搶青采摘。

表1 梔子藥材信息

續(xù)表

編號(hào)名稱產(chǎn)地來(lái)源信息批號(hào)其他信息s31梔子江西藥材市場(chǎng)購(gòu)買141201統(tǒng)貨s32梔子福建藥材市場(chǎng)購(gòu)買Y02115-1統(tǒng)貨s33梔子福建藥材市場(chǎng)購(gòu)買Y02115-2統(tǒng)貨s34梔子江西藥材市場(chǎng)購(gòu)買20171202-1統(tǒng)貨s35梔子福建藥材市場(chǎng)購(gòu)買20171202-2統(tǒng)貨s36梔子福建藥材市場(chǎng)購(gòu)買20171202-3統(tǒng)貨s37梔子福建藥材市場(chǎng)購(gòu)買20171202-4統(tǒng)貨S38梔子福建藥材市場(chǎng)購(gòu)買20171202-5統(tǒng)貨S39梔子福建藥材市場(chǎng)購(gòu)買20171202-6統(tǒng)貨s40梔子福建藥材市場(chǎng)購(gòu)買20171202-7統(tǒng)貨

圖1 在檢測(cè)波長(zhǎng)234 nm下梔子藥材液相色譜圖

圖2 在檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm下梔子藥材液相色譜圖

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各對(duì)照品適量，加入70%甲醇制得含綠原酸、梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ濃度分別為785.0、492.3、662.5、88.8 和87.2 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

取梔子藥材粉碎，過(guò)四號(hào)篩，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率350 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

Waters Xbridge TMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）－0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0-10 min，6%A；10-18 min，6%-12%A；18-22 min，12%-16%A；22-28 min，16%-20%A；28-40 min，20%A；40-60 min，20%-36%A；60-65 min，36%-55%A；65-75 min，55%-6%A）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；其中綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；梔子苷和京尼平龍膽雙糖苷檢測(cè)波長(zhǎng)為234 nm；西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm；取10 μL 溶液進(jìn)樣。在上述色譜條件下，梔子飲片中5 種有效指標(biāo)成分在其檢測(cè)波長(zhǎng)下與其它色譜峰分離度良好（圖1、圖2、圖3）（在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下梔子藥材液相色譜圖）。

2.2 線性關(guān)系考察

分別吸取1.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液稀釋得濃度依次為：綠原酸18.84、12.56、6.28、3.14、1.884、1.256 μg·mL-1；京 尼 平 龍 膽 雙 糖 苷158.94、105.96、52.98、26.49、15.894、10.596 μg·mL-1；梔子苷295.38、196.92、98.46、49.23、29.538、19.692 μg·mL-1；西 紅 花 苷Ⅰ47.95、32.96、15.98、7.99、4.79、3.20 μg·mL-1；西紅花苷Ⅱ5.233、3.489、1.744、0.872、0.5233、0.3489 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。分別以綠原酸、梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的進(jìn)樣含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程（表2）。

表2 五種指標(biāo)性成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3 精密度考察

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣量均為10 μL，記錄峰面積值，計(jì)算RSD值，結(jié)果綠原酸、梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的RSD 分別為1.18%、1.33%、1.30%、0.99%、0.95%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性考察

取樣品6 份，分別按供試品處理方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各指標(biāo)性成分含量。結(jié)果綠原酸、梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ平均含量分別為0.9、44.1、11.7、7.6、8.0 mg·g-1；RSD 分別為2.9%、2.6%、3.0%、3.0%、3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察

取同一樣品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量均為10 μL。結(jié)果綠原酸、梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD分別為1.73%、1.12%、1.51%、3.0%、3.0%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率考察

取同一批供試品，取0.050 0 g，精密稱定，共6份，按照100%精密加入上述5個(gè)對(duì)照品適量，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，在上述色譜條件下，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算回收率，結(jié)果綠原酸、梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的回收率分別為102.98%、98.39%、102.68%、101.03%、100.81%；RSD分別為2.11%、2.51%、1.52%、1.94%、1.59%。

2.7 含量測(cè)定結(jié)果

取15 批次梔子藥材粉末各0.1 g，精密稱定，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，按照外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定、計(jì)算各成分含量（表3）。

2.8 特征圖譜測(cè)定結(jié)果

測(cè)定并記錄40 批次梔子藥材分別記錄檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm、440 nm、330 nm下的液相色譜圖，并記錄特征峰峰面積值：440 nm下二萜苷類成分色譜峰以西紅花苷Ⅰ為對(duì)照，計(jì)算色譜峰3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)二萜苷成分含量，并計(jì)算二萜類成分總含量（表4）；330 nm下酚酸類成分色譜峰以綠原酸為對(duì)照，計(jì)算酚酸類成分總含量（表5）；240 nm 下以京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷成分含量計(jì)算總環(huán)烯醚萜苷類成分總含量（表6）。

2.9 不同產(chǎn)地梔子藥材及水梔子質(zhì)量差異分析

2.9.1 環(huán)烯醚萜苷類成分質(zhì)量差異分析

根據(jù)多批次梔子藥材環(huán)烯醚萜苷類特征圖譜比較發(fā)現(xiàn)，40批次梔子藥材的環(huán)烯醚萜苷類成分圖譜色譜峰相似，均以梔子苷和環(huán)烯醚萜苷為主要成分峰，梔子苷含量范圍為15.4-66.11 mg·g-1，京尼平龍膽雙糖苷含量范圍為3.74-24.74 mg·g-1，含量差異無(wú)明顯分類特征，其中三批次水梔子中京尼平龍膽雙糖苷含量較其他梔子藥材批次含量值中位值低。

以梔子藥材中京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷含量為數(shù)據(jù)，采用SIMCA-P12.0統(tǒng)計(jì)軟件PLS-DA模型，以梔子藥材不同產(chǎn)區(qū)分為江西、福建兩類，水梔子另做一類，共三類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，三類梔子藥材以梔子苷和環(huán)烯醚萜苷為變量因子，無(wú)法滿足分類條件。

2.9.2 二萜苷類成分質(zhì)量差異分析

根據(jù)多批次梔子藥材二萜苷類特征圖譜比較發(fā)現(xiàn)，40 批次梔子藥材的二萜苷類成分特征圖譜相似，但各成分含量有一定差異，西紅花苷Ⅰ含量范圍0.66-11.47 mg·g-1，西紅花苷Ⅱ含量范圍0.02-1.91 mg·g-1，以西紅花苷Ⅰ為對(duì)照計(jì)算的梔子藥材二萜苷類總含量范圍為1.02-18.66 mg·g-1，其中批次s7-s15，批次s34、s38梔子藥材的二萜苷類成分總含量為1.02-5.84 mg·g-1，遠(yuǎn)低于40批次含量中位值。

表3 40批次梔子藥材含量測(cè)定結(jié)果/(mg·g-1)

表4 梔子藥材二萜苷類特征圖譜峰面積值

表5 梔子藥材酚類特征圖譜峰面積值

表6 以梔子苷為參比的梔子藥材中各色譜峰相對(duì)峰面積比值

圖4 梔子藥材二萜苷類成分PLS-DA得分散點(diǎn)圖和變量重要性因子分布圖

以梔子藥材中二萜苷類成分色譜峰峰面積值為數(shù)據(jù)，采用SIMCA-P12.0統(tǒng)計(jì)軟件PLS-DA模型，以梔子藥材不同產(chǎn)區(qū)分為江西、福建兩類，水梔子另做一類，共三類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到PLS-DA得分散點(diǎn)圖、變量重要性因子分布圖（圖4）。由圖可知，以梔子二萜苷類色譜峰峰面積值為變量，江西產(chǎn)區(qū)與福建產(chǎn)區(qū)梔子藥材成散狀分布聚集，兩產(chǎn)區(qū)梔子藥材主要批次分類距離較近，其中江西產(chǎn)區(qū)s7-s15、s34、s28 批次藥材較為聚集，與主要梔子藥材質(zhì)量有一定差異，其他s21、s20、s29偏離較大，說(shuō)明質(zhì)量差異較大。由變量重要性因子分布圖可知，5號(hào)色譜峰為主要差異性成分，由色譜峰峰面積可知福建產(chǎn)區(qū)梔子5號(hào)二萜苷類成分峰面積值高于江西產(chǎn)區(qū)。

2.9.3 酚類成分質(zhì)量差異分析

通過(guò)梔子藥材在330 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下特征圖譜對(duì)比可知（圖5），福建產(chǎn)區(qū)梔子藥材在30 min 處有一個(gè)明顯的酚類成分特征峰11號(hào)特征峰，而江西產(chǎn)區(qū)梔子藥材15 min處8號(hào)特征峰（綠原酸）成分含量值明顯高于福建梔子藥材；三批水梔子在44 min 處均出現(xiàn)了一個(gè)明顯的酚類色譜峰21號(hào)特征的峰，區(qū)別于江西和福建產(chǎn)區(qū)梔子藥材。

圖5 檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm下梔子藥材酚類特征圖譜對(duì)比圖

圖6 梔子藥材酚類類成分PLS-DA得分散點(diǎn)圖和變量重要性因子分布圖

以梔子藥材中酚類成分色譜峰峰面積值為數(shù)據(jù)，采用SIMCA-P12.0 統(tǒng)計(jì)軟件PLS-DA 模型，以梔子藥材不同產(chǎn)區(qū)分為江西、福建兩類，水梔子另做一類，共三類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到PLS-DA得分散點(diǎn)圖、變量重要性因子分布圖（圖6）。由圖可知，以梔子酚類色譜峰峰面積值為變量，福建產(chǎn)區(qū)梔子、江西產(chǎn)區(qū)梔子分別聚為一處，水梔子單獨(dú)聚為一處，其中s11、s9、s29批次藥材質(zhì)量差異較大，與其他梔子藥材批次距離較大；由變量重要性因子分布圖可知，21號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、17號(hào)、8號(hào)、19號(hào)色譜峰為主要差異性成分。

2.9.4 梔子藥材質(zhì)量整體差異分析

圖7 梔子藥材全成分質(zhì)量PLS-DA得分散點(diǎn)和變量重要性因子分布圖

以梔子藥材中梔子苷色譜峰峰面積為參比，計(jì)算梔子藥材各色譜峰相對(duì)峰面積值，以相對(duì)峰面積值為數(shù)據(jù)，采用SIMCA-P12.0統(tǒng)計(jì)軟件PLS-DA模型，以梔子藥材不同產(chǎn)區(qū)分為江西、福建兩類，水梔子另做一類，共三類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到PLS-DA 得分散點(diǎn)圖、變量重要性因子分布圖（圖7）。由圖可知，以梔子藥材整體質(zhì)量分析，福建產(chǎn)區(qū)梔子、江西產(chǎn)區(qū)梔子分別聚為一處，水梔子單獨(dú)聚為一處，其中s9 批次藥材質(zhì)量差異較大，與其他梔子藥材批次距離較大；由變量重要性因子分布圖可知，21 號(hào)、11 號(hào)、12 號(hào)、17 號(hào)、8 號(hào)、19號(hào)、14號(hào)、5號(hào)、10號(hào)色譜峰為主要差異性成分。

3 分析與討論

以梔子藥材環(huán)烯醚萜苷成分比較，各產(chǎn)區(qū)梔子藥材質(zhì)量無(wú)明顯差異，水梔子中京尼平龍膽雙糖苷含量較低。

以梔子藥材二萜苷類成分為比較，不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材特征圖譜中5號(hào)特征峰為產(chǎn)區(qū)及梔子品種質(zhì)量差異性信息主要成分，福建產(chǎn)區(qū)5 號(hào)二萜苷類成分特征峰含量較江西產(chǎn)區(qū)高，批次s7-s15、s34、s28 梔子藥材質(zhì)量偏離，根據(jù)藥材來(lái)源信息可知，以上梔子批次搶青采摘，其二萜苷類成分含量較低，質(zhì)量表征與其他梔子藥材具有明顯差異，批次s20、s21為水梔子，其中二萜苷類成分質(zhì)量表征明顯區(qū)別于其他梔子藥材質(zhì)量，可見(jiàn)梔子二萜苷類成分含量差異與梔子藥材種源、采收、加工相關(guān)。

以梔子藥材中酚類成分為比較，不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材有明顯差異，其中福建梔子具有11 號(hào)特征峰，江西梔子具有8 號(hào)（綠原酸）特征峰高含量特征，水梔子具有21 號(hào)特征峰，區(qū)別于其他梔子藥材，其中不同產(chǎn)地水梔子也表現(xiàn)出酚類成分的產(chǎn)地差異特征。其中s11、s9、s29 批次藥材質(zhì)量差異較大，根據(jù)藥材來(lái)源信息可知，s9批次梔子藥材為梔子藥材與水梔子藥材混種種植，可見(jiàn)以酚類成分質(zhì)量表征差異，與種源、產(chǎn)地相關(guān)。

以梔子藥材整體質(zhì)量表征為比較，福建產(chǎn)區(qū)梔子、江西產(chǎn)區(qū)梔子分別聚為一處，水梔子單獨(dú)聚為一處，其中批次s9（與水梔子混種梔子藥材）質(zhì)量差異較大，與其他梔子藥材批次距離較大；由變量重要性因子分布圖可知，21 號(hào)、11 號(hào)、12 號(hào)、17 號(hào)、8 號(hào)、19 號(hào)、14 號(hào)、5號(hào)、10號(hào)色譜峰為主要差異信息成分。

綜上分析可知，以梔子藥材整體質(zhì)量表征為比較，可準(zhǔn)確區(qū)分梔子藥材種源、種植、產(chǎn)地、采收等信息；梔子藥材整體質(zhì)量表征差異研究結(jié)果，可為梔子藥材藥效表征差異提供化學(xué)研究基礎(chǔ)，進(jìn)一步提高梔子藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的整體性和客觀性。