基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測大薊治療高血壓的作用機制＊

馬新稱，黃燕秋，肖 雪，易法令

（1.廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院 廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥信息工程學(xué)院 廣州 510006）

高血壓是以動脈血壓持續(xù)升高為特征的“心血管綜合征”，近年來，其發(fā)病率普遍升高且發(fā)病年齡降低，嚴重患者多死于腦血管病和心腎衰竭[1-3]。目前，治療高血壓的主要措施為化學(xué)藥治療，但是化學(xué)藥在快速降壓的同時產(chǎn)生副作用，如β-受體阻斷劑類在降低血壓的同時可誘發(fā)哮喘[4]。研究表明部分中藥在發(fā)揮降壓作用的同時兼具器官保護作用[5,6]。研究中藥的降壓作用、篩選有效成分以及探討降壓作用機制，已然形成趨勢。

大薊為菊科植物薊Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分，收載于《中國藥典》（2015 年版），其味甘、苦，性涼，歸心、肝經(jīng)，有涼血止血、散瘀解毒消癰之功效[7]。現(xiàn)代藥理研究表明，大薊具有抗腫瘤、抑菌、治療糖尿病、肥胖、保肝護肝等多種藥理作用[8,9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)大薊根水劑、堿液、酸性醇浸出液等均有降壓作用[10]。臨床上，大薊根與杜仲葉、夏枯草合用可安全有效降壓，并且對高血壓易感者具有早期預(yù)防、強身保健的作用[11]。作用機制方面，大薊主要通過內(nèi)皮細胞釋放NO發(fā)揮降壓作用[12]。但是，中藥發(fā)揮療效具有多成分、多靶點的特點，目前對于大薊發(fā)揮降壓作用的藥效成分及作用機制尚缺乏系統(tǒng)認識。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物分子網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，從相互聯(lián)系的角度研究問題，與中藥的核心思想不謀而合，在預(yù)測中藥活性成分群及作用靶點、闡明作用機制、解釋中藥配伍規(guī)律、發(fā)現(xiàn)新的臨床適用癥等方面具有廣泛應(yīng)用[13,14]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法首次從整體上分析中藥大薊治療高血壓疾病的作用機制，發(fā)現(xiàn)大薊治療高血壓疾病的潛在藥效成分、新的作用靶點及信號通路，促進大薊的臨床應(yīng)用，同時為高血壓疾病的機制研究提供方向。

表1 26種大薊化學(xué)成分信息

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分與作用靶點收集

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集大薊的所有化學(xué)成分及相應(yīng)作用靶點。

1.2 成分-靶點核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)節(jié)點、邊等屬性。其中，節(jié)點分別代表成分和作用靶點，邊代表成分與靶點的相互作用關(guān)系。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的邊、節(jié)點分別成分和和靶點的節(jié)點平均度，據(jù)此提取大薊“成分-靶點”核心網(wǎng)絡(luò)[15]。其中，節(jié)點度是指與節(jié)點相關(guān)聯(lián)的邊的數(shù)目，代表成分與靶點的關(guān)聯(lián)程度，節(jié)點平均度代表成分與靶點關(guān)聯(lián)的平均程度。

1.3 疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將成分作用的核心靶點轉(zhuǎn)換為人類基因名，并與GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://www.omim.org/）和TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）數(shù)據(jù)庫中已報道的與原發(fā)性高血壓相關(guān)靶點進行比對，采用Venn diagrams（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）提取共有靶點，即為原發(fā)性高血壓疾病靶點，構(gòu)建疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 生物學(xué)功能與通路分析

為了進一步研究關(guān)鍵靶點涉及的生物學(xué)功能及信號通路，利用Cytoscape3.6.1軟件中的CluGO插件對關(guān)鍵靶點進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。其中，GO功能富集和KEGG通路富集分析均設(shè)置參數(shù)為P ＜0.05。

1.5 成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了從整體上分析成分、靶點與信號通路之間的相互作用關(guān)系，采用Cytoscape3.6.1 軟件中的Merge 功能將“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)與上述“成分-靶點”核心網(wǎng)絡(luò)進行合并，構(gòu)建大薊“成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分與作用靶點收集

收集TCMSP 數(shù)據(jù)庫中大薊的所有化學(xué)成分及相應(yīng)作用靶點，得到26 種化學(xué)成分（表1）和119 個作用靶點，共計289對成分-靶點相互作用關(guān)系。

2.2 成分-靶點核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

所構(gòu)建的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中共包含145 個節(jié)點和285 條邊，其中285 條邊代表成分和靶點的相互作用；26個節(jié)點代表化學(xué)成分，節(jié)點平均度為10.96，大于節(jié)點平均度的成分有11 個；119 個節(jié)點代表成分作用靶點，節(jié)點平均度為2.39，大于節(jié)點平均度的靶點有33個，據(jù)此提取大薊成分-靶點核心網(wǎng)絡(luò)（圖1）。

2.3 疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

在GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫中共計檢索得到5193個原發(fā)性高血壓相關(guān)基因，從中提取得到29個原發(fā)性高血壓疾病靶點，并構(gòu)建疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（圖2）。

2.4 生物學(xué)功能與通路分析

在GO 功能富集分析中，共確定27 條GO 條目，其中21 條生物過程主要涉及腺苷酸環(huán)化酶抑制G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體、通過化學(xué)信號調(diào)節(jié)心臟收縮力等；6條分子功能包括兒茶酚胺結(jié)合、兒茶酚胺G 蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、腎上腺素能受體活性以及α-腎上腺素能受體活性（圖3）。

圖1 成分-靶點核心網(wǎng)絡(luò)

圖2 疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過KEGG 通路富集分析，共得到13條相關(guān)通路（圖4）。結(jié)果顯示大薊治療高血壓機制主要涉及脂肪細胞中的脂肪分解、鈣信號通路、酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、唾液分泌等信號通路。

2.5 成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為進一步研究成分、靶點與信號通路之間的相互作用關(guān)系，采用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建“靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)，并采用Merge 功能將其與上述“成分-靶點”核心網(wǎng)絡(luò)進行合并，構(gòu)建大薊“成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)(圖5)。結(jié)果顯示中藥大薊中的發(fā)揮抗高血壓作用的化學(xué)成分主要包括油酸、豆甾醇、紫丁香酚苷、鄰苯二甲酸二丁酯，協(xié)同作用于PTGS1、PTGS2、CHRM3、CHRM1、SLC6A2、CHRM2、ADRβ2、SLC6A3等靶點，參與心臟收縮力調(diào)節(jié)、鈣信號通路、氨基酸代謝等13 條信號通路(表2)。

圖4 KEGG通路富集分析條形圖

3 討論

本文構(gòu)建的“成分-靶點”核心網(wǎng)絡(luò)中，涉及大薊11種藥效成分和33個靶點。其中，發(fā)揮大薊抗高血壓作用的潛在藥效物質(zhì)主要為油酸、豆甾醇、紫丁香酚苷、鄰苯二甲酸二丁酯等，以上4種關(guān)鍵藥效成分共同作用于PTGS1 和PTGS2 靶點，而油酸、豆甾醇和鄰苯二甲酸二丁酯三種成分作用于RXRα 靶點，紫丁香酚苷、鄰苯二甲酸二丁酯和豆甾醇共同作用于CHRM2、ADRα1A、SLC6A2、CHRM1、SLC6A3、ADRβ2 和CHRM3，體現(xiàn)了中藥多成分協(xié)同作用的特點。

圖5 成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)

在“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中，共計有29個高血壓疾病靶點，主要為PTGS1、PTGS2、CHRM3、CHRM1、SLC6A2、CHRM2、ADRβ2、SLC6A3 等。研 究 表 明，PTGS1 和PTGS2 均為前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶，其中PTGS2 基因與女性高血壓病的發(fā)生密切相關(guān)[16]。CHRM3、CHRM1及CHRM2分別是毒蕈堿乙酰膽堿受體的不同亞型，研究發(fā)現(xiàn)CHRM3 與原發(fā)性高血壓患者染色體q43位置具有關(guān)聯(lián)[17]。作為去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體，SLC6A2在“遞質(zhì)-受體”信號傳導(dǎo)通路中具有重要的調(diào)控作用，流行病學(xué)研究表明SLC6A2 基因多態(tài)性與高血壓疾病具有相關(guān)性[18]。此外，黃昉萌等[19]研究發(fā)現(xiàn)高血壓病肝陽上亢證患者攜帶SLC6A2 啟動子2 的GC/CC 型頻率高于非肝陽上亢證患者，推測SLC6A2多態(tài)性影響交感神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，進而表現(xiàn)出肝陽上亢證證候群。Kim 等[20]揭示了SLC6A3 與高血壓之間的遺傳關(guān)聯(lián)，并且SLC6A3的特異性VNTR等位基因可能是高血壓的危險因素。ADRβ2 則是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，介導(dǎo)心臟交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對血壓的短期和長期調(diào)節(jié)均有影響[21]。以上基因功能均與高血壓相關(guān)，分析大薊可能通過這些關(guān)鍵靶點發(fā)揮降壓作用。

對預(yù)測的關(guān)鍵靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，進一步探究大薊降低高血壓的作用機制。富集的生物學(xué)過程包括通過化學(xué)信號調(diào)節(jié)心臟收縮力、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體激活磷脂酶C、G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體抑制腺苷酸環(huán)化酶等，通路富集分析顯示其參與脂肪細胞中的脂肪分解、鈣信號通路、酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、唾液分泌等信號通路。文獻報道，大部分藥物治療高血壓的作用機制主要涉及降低心肌收縮力以減少血容量、選擇性阻滯平滑肌細胞鈣離子內(nèi)流、舒張血管、改善血管內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)血脂等方面[3]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測大薊作用于ADRβ1、ADRβ2、ADRα1A、ADRα1B 等腎上腺素能受體和鈉通道蛋白亞基SCN5α，提示其降低心肌細胞收縮力和減少血容量而發(fā)揮降壓作用；而PRKACα、ADRβ1、ADRβ2、NOS2、NOS3、HTR2A、CHRM2、CHRM1、CHRM3、ADRα1A 和ADRα1B 靶點均涉及鈣信號通路，其可能通過選擇性阻滯鈣離子內(nèi)流呈現(xiàn)降壓作用。其中，NOS2 和NOS3 與精氨酸和脯氨酸代謝相關(guān)，推測二者亦參與調(diào)節(jié)精氨酸和脯氨酸代謝發(fā)揮降血壓作用；PTGS1和PTGS2為前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶，研究表明二者可與分布在血小板和內(nèi)皮細胞上的前列環(huán)素受體G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合激

活G蛋白，引起細胞內(nèi)cAMP 水平升高，進而抑制血小板聚集，血管平滑肌松弛[22]。此外，血脂的升高可致血液粘稠增加，PTGS2 和PTGS1 可能與PRKACα、ADRβ 1、ADRβ2、PTGS2、PTGS1等靶點共同參與調(diào)節(jié)脂肪細胞中的脂肪分解、降低血液粘稠度從而降低血壓。

表2 關(guān)鍵疾病靶點及信號通路

總之，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建“成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)，從整體上分析大薊成分、靶點、信號通路之間的相互作用關(guān)系，推測中藥大薊通過油酸、豆甾醇、紫丁香酚苷、鄰苯二甲酸二丁酯等潛在藥效成分 協(xié) 同 作 用 于PTGS1、PTGS2、CHRM3、CHRM1、SLC6A2、CHRM2、ADRβ2、SLC6A3 等多個靶點，參與心臟收縮力調(diào)節(jié)、鈣信號通路、氨基酸代謝等多條信號通路發(fā)揮治療高血壓疾病的作用，為中藥大薊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與機制研究提供方向?；谝陨暇W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的預(yù)測結(jié)果，擬進一步對大薊的潛在藥效成分和作用機制開展實驗驗證。