miR-7a-5p對急性胰腺炎腺泡細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

樓一波, 王曉華, 傅志成

樓一波, 王曉華, 義烏市中心醫(yī)院急診科 浙江省義烏市 322000

傅志成, 義烏市中心醫(yī)院消化科 浙江省義烏市 322000

核心提要: 本研究采用雨蛙肽處理AR42J細(xì)胞構(gòu)建急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)細(xì)胞模型,分析miR-7a-5p對胰腺炎細(xì)胞增殖及凋亡的影響,初步驗(yàn)證其作用靶基因,為揭示AP發(fā)病機(jī)制及治療方法奠定理論基礎(chǔ).

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床常見疾病,胰腺腺泡細(xì)胞增殖及凋亡與AP發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[1-3].因而尋找與胰腺腺泡細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)的分子標(biāo)志物對臨床診斷及治療AP具有重要意義. 微小RNA-7a-5p(microRNA-7a-5p, miR-7a-5p)表達(dá)異常與缺血性腦損傷密切相關(guān), miR-7在重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)和輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)患者血清中呈高表達(dá)[4,5]. 活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子的蛋白抑制因子-1(protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription 1,PIAS1)在AP腺泡細(xì)胞中呈低表達(dá)[6]. 雨蛙肽可刺激膽囊收縮及胰酶分泌并可促使胰腺腺泡細(xì)胞凋亡導(dǎo)致組織損傷[7]. 但關(guān)于miR-7a-5p在AP中的表達(dá)及其對AP腺泡細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚未見報(bào)道. 因此, 本研究采用雨蛙肽處理AR42J細(xì)胞構(gòu)建AP細(xì)胞模型, 分析沉默miR-7a-5p表達(dá)及PIAS1過表達(dá)對雨蛙肽刺激胰腺腺泡細(xì)胞增殖及凋亡的影響, 為臨床治療AP及基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠胰腺AR42J腺泡細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫. 雨蛙肽購自美國Sigma公司; 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)及青鏈霉素均購自美國Gibco公司; Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑及Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司; PVDF膜購自美國Millipore公司; 兔抗鼠GAPDH抗體、PIAS1抗體及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的IgG二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司; BCA蛋白定量檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司; miR-7a-5p mimic、anti-miR-7a-5p及其各自陰性對照質(zhì)粒均購自上海吉瑪基因公司; qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司; 蛋白裂解液購自上海生工生物工程有限公司; 熒光素酶活性檢測試劑盒及熒光素酶報(bào)告載體均購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司; pcDNA載體購自美國Addgene公司.

1.2 方法

1.2.1 胰腺炎細(xì)胞模型的構(gòu)建: 大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基, 培養(yǎng)基含有10% FBS、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 g/L), 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞, 48 h更換培養(yǎng)液. 收集AR42J細(xì)胞, 接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 密度為1×106個(gè)/孔, 當(dāng)細(xì)胞貼壁生長后加入濃度為100 nmol/L的雨蛙肽刺激細(xì)胞, 6 h后收集細(xì)胞上清液, 經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測淀粉酶、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎性因子表達(dá)水平, 結(jié)果顯示雨蛙肽處理后炎性因子表達(dá)水平顯著高于對照細(xì)胞組, 提示建模成功[8]. 收集胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J用于后續(xù)研究.

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組: 未經(jīng)雨蛙肽處理的AR42J細(xì)胞為對照組, 經(jīng)雨蛙肽處理的AR42J細(xì)胞為雨蛙肽組. 收集雨蛙肽組對數(shù)生長期AR42J細(xì)胞接種于6孔板, 密度為3×105個(gè)/孔, 待細(xì)胞融合至50%左右時(shí)(2 d), 以antimiR-NC和anti-miR-7a-5p分別與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑混合加入不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)液, 即分別為雨蛙肽組+anti-miR-NC組、雨蛙肽組+anti-miR-7a-5p組.分別將pcDNA、pcDNA-PIAS1轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞, 即分別為雨蛙肽+pcDNA組、雨蛙肽+pcDNA-PIAS1組. 轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h, 收集細(xì)胞.

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-7a-5p表達(dá): 用1.5 mL試管收集各組AR42J細(xì)胞, 利用離心機(jī)離心細(xì)胞, 棄上清, PBS洗滌, 分別加入Trizol試劑1 mL提取總RNA, 測定RNA濃度與純度, 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, 以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng). PCR擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min循環(huán)1次,95 ℃變性15 s, 60 ℃退火60 s, 72 ℃延伸30 s, 共循環(huán)40次. miR-7a-5p以U6為內(nèi)參基因, 采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù).每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù).

1.2.4 Western blot檢測PIAS1蛋白表達(dá): 收集各組AR42J細(xì)胞, 加入蛋白裂解液提取總蛋白, 測定蛋白濃度及純度, 將SDS-PAGE電泳結(jié)束后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜, 2 h后將其置于5%脫脂牛奶封閉液, 室溫放置2 h, 加入1000倍稀釋的PIAS1一抗, 4 ℃孵育過夜, 次日采用Tis-HCI緩沖液(TBST)洗膜, 清洗3次, 每次15 min, 放入稀釋2000倍二抗中, 室溫反應(yīng)2 h, TBST清洗, 加入ECL顯色, 置于Bio-Rad凝膠電泳成像儀中分析蛋白條帶, 利用Quantity One軟件分析蛋白相對表達(dá)量, 每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù).

1.2.5 MTT檢測細(xì)胞增殖: 取各組對數(shù)生長期AR42J細(xì)胞, 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞(1.5×105/mL), 以每孔接種細(xì)胞體積20 μL接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h, 每孔加入40 μL MTT溶液, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 每孔加入200 μL DMSO, 分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h, 置于酶標(biāo)儀檢測各孔在波長為490 nm時(shí)細(xì)胞光密度值(optical density, OD), OD值大小表示細(xì)胞增殖能力, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù), 求取平均值.

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡: 分別取各組AR42J細(xì)胞, 制備重懸細(xì)胞, 接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(5×105個(gè)/孔),分別加入5 μL Annexin V-FITC, 室溫避光孵育, 15 min后加入5 μL PI染色液, 利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率.

1.2.7 熒光素酶檢測: 通過TargetScan、miRanda等生物信息學(xué)軟件預(yù)測PIAS1可能是miR-7a-5p的靶基因, 取對數(shù)生長期AR42J細(xì)胞, 接種于96孔板(1.5×104個(gè)/孔),WT-PIAS1分別與miR-NC、miR-7a-5p mimics共轉(zhuǎn)染;MUT-PIAS1分別與miR-NC、miR-7a-5p mimics共轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞, 檢測AR42J細(xì)胞相對熒光素酶活性, 嚴(yán)格按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0分析數(shù)據(jù),應(yīng)用GraphPad Prism7軟件作圖, 計(jì)量資料以mean±SD表示, 兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 多組間比較采用單因素方差分析; 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn), 各組數(shù)據(jù)均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

圖1 淀粉酶、TNF-α、IL-6含量.

圖2 miR-7a-5p和PIAS1在胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J中的表達(dá).

2 結(jié)果

2.1 AP模型檢測 與對照組相比, 雨蛙肽組AR42J細(xì)胞上清液中淀粉酶含量、TNF-α含量、IL-6含量均顯著升高(圖1), 提示造模成功.

2.2 miR-7a-5p和PIAS1在胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J中的表達(dá) 對照組AR42J細(xì)胞中miR-7a-5p表達(dá)水平較低, 雨蛙肽組AR42J細(xì)胞中miR-7a-5p表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)(圖1A). Western blot檢測結(jié)果顯示雨蛙肽組AR42J細(xì)胞中PIAS1蛋白表達(dá)顯著低于對照組(P＜0.05)(圖1B、1C).

2.3 抑制miR-7a-5p表達(dá)對胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖的影響 雨蛙肽+anti-miR-7a-5p組AR42J細(xì)胞中miR-7a-5p表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),提示轉(zhuǎn)染成功(圖2A). 與對照組相比, 雨蛙肽組AR42J細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05);與雨蛙肽+anti-miR-NC組相比, 雨蛙肽+anti-miR-7a-5p組AR42J細(xì)胞活性顯著升高(P＜0.05)(圖2B). 表明抑制miR-7a-5p表達(dá)可促進(jìn)胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖.

2.4 抑制miR-7a-5p表達(dá)對胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J凋亡的影響 與對照組相比, 雨蛙肽組AR42J細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05), 雨蛙肽+anti-miR-7a-5p組AR42J細(xì)胞凋亡率顯著低于雨蛙肽+anti-miR-NC組(P＜0.05)(圖3). 結(jié)果表明抑制miR-7a-5p表達(dá)可抑制胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J凋亡.

2.5 miR-7a-5p靶向調(diào)控PIAS1的表達(dá) 共轉(zhuǎn)染miR-7a-5p mimic與WT-PIAS1質(zhì)粒后, 熒光強(qiáng)度相較于轉(zhuǎn)染miR-7a-5p對照質(zhì)粒與WT-PIAS1質(zhì)粒明顯降低(P＜0.05); 共轉(zhuǎn)染miR-7a-5p mimic與MUT-PIAS1質(zhì)粒后, 熒光強(qiáng)度相較于轉(zhuǎn)染miR-7a-5p對照質(zhì)粒與MUT-PIAS1質(zhì)粒差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05). miR-7a-5p組胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J中PIAS1蛋白表達(dá)水平較miR-NC組明顯降低(P＜0.05); antimiR-7a-5p組AR42J細(xì)胞中PIAS1蛋白表達(dá)水平較miRNC組明顯升高(P＜0.05)(圖4). 結(jié)果表明PIAS1是miR-7a-5p的靶基因, miR-7a-5p可負(fù)向調(diào)控PIAS1表達(dá).

（11）以多分類變量newsubgroup為反應(yīng)變量，對各協(xié)變量建立多分類Logistic回歸模型，并計(jì)算該模型判對率。

2.6 PIAS1過表達(dá)對胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡的影響 雨蛙肽+pcDNA-PIAS1組AR42J細(xì)胞中PIAS1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)(圖5A、5B). 雨蛙肽+pcDNA-PIAS1組AR42J細(xì)胞活性顯著高于雨蛙肽+pcDNA組(P＜0.05), AR42J細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05)(圖5C、5D).

2.7 抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-7a-5p表達(dá)對雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡的作用 antimiR-7a-5p+si-PIAS1組AR42J細(xì)胞活性低于anti-miR-7a-5p+si-NC組(P＜0.05), 細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)(圖6).結(jié)果表明抑制PIAS1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-7a-5p表達(dá)對雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡的作用.

3 討論

胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式為壞死時(shí)可造成重癥胰腺炎, 若胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式為凋亡時(shí)可造成輕度胰腺炎[9,10].AR42J細(xì)胞屬于大鼠胰腺腺泡細(xì)胞瘤細(xì)胞, 具有利于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高及刺激反應(yīng)敏感性較大等優(yōu)點(diǎn)[11]. 故此本研究選用AR42J細(xì)胞為研究對象. 既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA對AP早期診斷及評估病情進(jìn)展均具有應(yīng)用價(jià)值[12]. 本研究旨在揭示AP發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制, 為臨床治療胰腺炎提供新方向.

本研究結(jié)果顯示雨蛙肽組AR42J細(xì)胞中miR-7a-5p表達(dá)水平顯著升高, 研究表明AP患者血清中miR-7表達(dá)水平明顯升高并可用于早期診斷AP及評估疾病進(jìn)展[13,14].Ballegaard等[15]研究報(bào)道指出miR-7可作為全身性炎癥的標(biāo)志物. 本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似, 研究報(bào)道指出胰腺腺泡細(xì)胞增殖并抑制其凋亡可降低體內(nèi)炎癥反應(yīng), miR-7可減輕腦出血大鼠腦炎癥[16,17]. Cao等[18]研究發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA SNHG1通過調(diào)節(jié)miR-7/NLRP3途徑促進(jìn)帕金森病神經(jīng)炎癥. 提示miR-7a-5p表達(dá)水平異常升高可能引發(fā)AP. 本研究發(fā)現(xiàn)雨蛙肽組AR42J細(xì)胞活力顯著低于對照組, 細(xì)胞凋亡率升高, 抑制miR-7a-5p表達(dá)可促進(jìn)AR42J細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡. 分析原因可能為抑制miR-7a-5p表達(dá)可通過減少AR42J細(xì)胞凋亡進(jìn)而緩解AP炎癥反應(yīng). 提示miR-7a-5p表達(dá)水平升高可能通過促進(jìn)AR42J細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重AP炎癥反應(yīng). 本研究進(jìn)一步探究miR-7a-5p在AP發(fā)生過程中的作用機(jī)制, 靶基因預(yù)測顯示PIAS1可能為miR-7a-5p的靶基因, 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明miR-7a-5p可靶向結(jié)合PIAS1, 并可負(fù)向調(diào)控PIAS1表達(dá), 研究表明PIAS1在AP大鼠中呈低表達(dá)并與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān), 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PIAS1可通過調(diào)控STAT1等多種信號通路進(jìn)而發(fā)揮抑制炎癥作用[19,20]. 與上述研究報(bào)道結(jié)果相似, 本研究結(jié)果顯示雨蛙肽組AR42J細(xì)胞中PIAS1表達(dá)降低, 說明PIAS1在雨蛙肽誘導(dǎo)的AP模型AR42J細(xì)胞中呈低表達(dá). 探究AP發(fā)病機(jī)制發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)大量釋放是引起全身炎癥綜合反應(yīng)特征及患者死亡的主要原因[21,22]. Chen等[23]研究顯示PIAS1可直接調(diào)控MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而參與疾病發(fā)生及發(fā)展過程. 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PIAS1過表達(dá)可促進(jìn)胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖并抑制其凋亡, 分析原因可能為PIAS1水平升高增強(qiáng)其對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制作用而抑制炎癥介質(zhì)釋放進(jìn)而降低炎癥反應(yīng), 但關(guān)于其是否通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用需深入探究.

綜上所述, miR-7a-5p在AR42J細(xì)胞中呈高表達(dá)并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖, 本研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)miR-7a-5p可通過負(fù)向調(diào)控靶基因PIAS1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)AP發(fā)生及發(fā)展, 但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索, 可為miR-7a-5p在AP發(fā)病機(jī)制中的研究及AP治療提供理論基礎(chǔ).

圖3 抑制miR-7a-5p表達(dá)對胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖的影響.

圖4 抑制miR-7a-5p表達(dá)對胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J凋亡的影響.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)發(fā)病率逐年升高,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量, 目前關(guān)于AP發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,

miRNA作為內(nèi)源性非編碼小RNA分子廣泛分布于多種組織或器官中, 其異常表達(dá)可參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程, 本研究試圖尋找miRNA與AP發(fā)生及發(fā)展的相關(guān)性,揭示其潛在作用機(jī)制, 為臨床研發(fā)治療藥物或制定治療方案提供依據(jù).

圖5 miR-7a-5p靶向調(diào)控PIAS1的表達(dá).

圖6 PIAS1過表達(dá)對胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡的影響.

圖7 胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究主題為揭示miR-7a-5p與AP發(fā)生及發(fā)展的相關(guān)性及其潛在作用機(jī)制, 擬解決的問題是為揭示AP致病機(jī)制提供新方向, 為進(jìn)一步揭示AP致病機(jī)制提供理論依據(jù).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究主要目標(biāo)是揭示miR-7a-5p與活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子的蛋白抑制因子-1(protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription 1, PIAS1)在AP致病機(jī)制的靶向關(guān)系, 可為下一步體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ), 對臨床提高AP治療效果提供參考.

實(shí)驗(yàn)方法

本研究選用雨蛙肽素構(gòu)建AP模型, 檢測胰腺炎細(xì)胞中miR-7a-5p與PIAS1表達(dá)水平, 檢測抑制miR-7a-5p表達(dá)及PIAS1過表達(dá)對細(xì)胞增殖、凋亡的影響, 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-7a-5p與PIAS1的靶向作用. 在胰腺炎細(xì)胞中首次驗(yàn)證miR-7a-5p與PIAS1的靶向關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究證實(shí)胰腺炎細(xì)胞中miR-7a-5p表達(dá)升高, PIAS1表達(dá)降低, 抑制miR-7a-5p表達(dá)或PIAS1過表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡, 雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-7a-5p可負(fù)向調(diào)控靶基因PIAS1的表達(dá)活性, 抑制PIAS1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-7a-5p表達(dá)對細(xì)胞增殖及凋亡的作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-7a-5p與PIAS1的靶向調(diào)控關(guān)系; 首次提出miR-7a-5p可負(fù)向調(diào)控PIAS1表達(dá)而參與胰腺細(xì)胞增殖及凋亡過程; 為miRNA與AP致病機(jī)制的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)提供新理論; 針對miR-7a-5p與AP的相關(guān)性可進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn), 還需研究其與相關(guān)信號通路的作用關(guān)系, 構(gòu)建整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò); 證實(shí)AP中miR-7a-5p可靶向負(fù)性調(diào)控PIAS1的表達(dá), 為未來研究提供理論依據(jù).

展望前景

經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn): 選用適宜濃度的雨蛙肽構(gòu)建AP模型, 收集細(xì)胞及處理細(xì)胞時(shí)需謹(jǐn)慎小心, 避免失誤, 減少失誤; 未來方向: 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究, 尋找miR-7a-5p上游調(diào)控基因LncRNA或circRNA; 最佳方法: 細(xì)胞實(shí)驗(yàn), 體內(nèi)實(shí)驗(yàn), 測序分析.