高粱原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化方法研究

謝 鑫， 蔣君梅1， 王 勇1， 任明見(jiàn)

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025； 2.國(guó)家小麥改良中心貴州分中心， 貴陽(yáng) 550025)

近年來(lái)對(duì)高粱的研究主要集中在采用基因工程手段培育抗病、抗寒、抗逆的高粱品種等方面[3-5]。但是，由于高粱轉(zhuǎn)化及再生體系技術(shù)還不成熟，制約了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究高粱基因功能，而利用原生質(zhì)體可以對(duì)植物基因功能進(jìn)行快速驗(yàn)證，因而，對(duì)高粱原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。20世紀(jì)60年代，Cocking等第一次從藻類分離出原生質(zhì)體以來(lái)，陸續(xù)從小麥、玉米、水稻、大麥等禾本科植物及木本植物中成功分離出原生質(zhì)體[6-8]，原生質(zhì)體的應(yīng)用也擴(kuò)展到基因瞬時(shí)表達(dá)、蛋白亞細(xì)胞定位、蛋白-蛋白互作、啟動(dòng)子分析以及種質(zhì)資源改良等領(lǐng)域。目前，有報(bào)道用高粱懸浮細(xì)胞制備原生質(zhì)體的方法[9]，但是該方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不利于快速驗(yàn)證基因功能的需要。本研究采用高粱黃化苗進(jìn)行原生質(zhì)制備，轉(zhuǎn)化過(guò)程只需要2 d時(shí)間，簡(jiǎn)單、快速。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試植物材料

供試的高粱樣品為BTx 623，來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。

1.1.2供試試劑

纖維素酶Cellulose R 10 和果膠酶Macerozyme R 10購(gòu)自日本Yakult Pharmaceutical公司；甘露糖、聚乙二醇4000、氯化鈣、EDTA、氯化銫、MES、KCl等購(gòu)自Sigma公司；甘油、正丁醇、異丙醇、醋酸鉀、SDS、氯化鈉、氫氧化鈉等為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備

主要儀器：超速冷凍離心機(jī)(BECKMAN，L100-XP)、臺(tái)式離心機(jī)(EPPENDORF，5424-R)、激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS，F(xiàn)V-1000)、普通光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)、光照培養(yǎng)箱、搖床和真空泵(WELCH，Model 2522 c-02)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1植物材料培養(yǎng)

選取健康的高粱種子BTx 623于室溫下在清水中浸泡24 h，使種子充分吸水，每隔12 h換1次水，24 h后倒掉水，種子用濕紗布蓋住，持續(xù)室溫放置24 h，直至種子長(zhǎng)出白色的芽。然后將其播種于育苗盤中，播種后置于25 ℃光照下至苗長(zhǎng)齊(1～2 d)，25 ℃黑暗培養(yǎng)8～10 d。

1.2.2氯化銫密度梯度離心法制備質(zhì)粒

氯化銫密度梯度離心法制備質(zhì)粒參考Li J F等[10]的方法并做改動(dòng)，具體如下： 1) 接種大腸桿菌(含有GFP或YFP熒光蛋白的質(zhì)粒)于5 mL的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床復(fù)蘇培養(yǎng)8 h； 2) 取3 mL復(fù)蘇好的菌液倒入500 mL的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h； 3) 在超速離心機(jī)于40 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min收集沉淀； 4) 加40 mL Solution I(10 mM EDTA，pH 8.0)震蕩重懸； 5) 加入80 mL Solution II(200 g醋酸鉀溶解到500 mL水中，加120 mL醋酸，定容至800 mL)立即混勻； 6) 加入30 mL Solution III(0.1 M NaOH，1% SDS)上下顛倒5次，室溫靜置5 min； 7) 40 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min棄沉淀； 8) 在沉淀中加入250 mL異丙醇上下顛倒混勻，40 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min 棄上清； 9) 加入4 mL 10 mM EDTA重懸沉淀； 10) 將上清與5.5 g氯化銫、100μL溴化乙啶(10 mg·mL-1)混勻，轉(zhuǎn)入快封式超速離心管中(BECKMAN，貨號(hào)342412)，60 000 r·min-1，4 ℃，離心16 h； 11) 用注射器抽取溴化乙啶染色的DNA條帶與7 mL正丁醇(用1 M NaCl飽和處理)混勻，再加入5 mL無(wú)菌水，并出現(xiàn)正丁醇/水/DNA分層，去掉正丁醇和水項(xiàng)； 12) 用無(wú)水乙醇和75% 漂洗DNA后，加水溶解至約2μg/μL備用。

1.2.3原生質(zhì)體的制備與純化

1) 高粱黃化苗的預(yù)處理。

剪取生長(zhǎng)良好的高粱黃化苗50株，去掉根放于0.6 M甘露醇中預(yù)處理10 min，剪去葉，取中間的葉鞘部分，用刀片切成0.5 mm細(xì)條。

2) 酶解處理。

把切好的葉鞘移入含有20 mL酶解液的50 mL三角瓶中；用真空泵-40 kPa抽真空20 min后，在黑暗中消化酶(28 ℃，80 r·min-1，酶解液加入鏈霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng))，期間顯微鏡檢查原生質(zhì)體裂解狀態(tài)。

原生質(zhì)體酶解液按如下方法制備而成：稱取0.3 g Cellulose R 10，0.75 g Macerozyme R 10，2.184 g Mannitol，800μL 0.5 M MES(pH=5.7)，20μL 1 M CaCl2，0.02 g BSA，最后用ddH2O定容至20 mL，細(xì)菌過(guò)濾器抽濾滅菌備用。

3) 原生質(zhì)體濃縮與純化。

使用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾裂解的原生質(zhì)體，用少量W 5提前潤(rùn)濕尼龍網(wǎng)，過(guò)濾到50 mL離心管。殘?jiān)肳 5漂洗再過(guò)濾，合并濾液。室溫下1 000 g離心5 min，沿離心管壁倒入10 mL預(yù)冷的緩沖液W 5，重懸沉淀，離心。重復(fù)上一步2次。吸去上清，用預(yù)冷的W 5重懸沉淀，調(diào)節(jié)原生質(zhì)體濃度為106個(gè)·mL-1，冰上放置30 min。

上述緩沖液W 5按照如下方法制備而成：稱取0.37 g的KCl，18.4 g的CaCl2，9.0 g的NaCl，0.3 g的MES和0.9 g的glucose，加ddH2O至900 mL，用KOH調(diào)節(jié)pH至5.7，定容至1 L，滅菌備用。

1.2.4酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

取長(zhǎng)勢(shì)一致、相同數(shù)量(1 g鮮重)的幼苗進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6，7 h和8 h。然后用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體濃度，以明確最佳酶解時(shí)間。

1.2.5原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

將2μg提取的質(zhì)粒DNA，分別加到2 mL離心管底部，向管中加入100μL高粱原生質(zhì)體，輕輕混勻；每管中加入80μL 40% PEG溶液，輕輕混勻，室溫靜置孵育10 min；加入320μL的W 5，輕柔顛倒混勻，終止轉(zhuǎn)化；室溫1 000 g，離心3 min；去上清(剩約50μL)，緩慢加入500μL的W 5，輕柔顛倒混勻，室溫1 000 g，離心3 min ；將樣品置于室溫培養(yǎng)12 h后，用于熒光觀察。

圖1 高粱幼苗的處理

2 結(jié)果與分析

2.1 分離原生質(zhì)體

對(duì)經(jīng)過(guò)催芽后避光培養(yǎng)8 d的高粱幼苗(圖1 A)進(jìn)行收集，用于原生質(zhì)體的制備。去除幼苗的根部后立即浸泡于0.6 M甘露醇中預(yù)處理10 min(圖1 B)，這有利于維持離體的高粱幼苗體內(nèi)滲透壓的平衡。用剪刀剪去葉片，取莖部組織，用刀片切碎后(不能反復(fù)切，以免細(xì)胞受到損傷)放置在含有酶解液的三角瓶中(圖1 C、D)，抽真空20 min使得酶解液充分進(jìn)入高粱組織。

2.2 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

酶解時(shí)間是原生質(zhì)體分離的關(guān)鍵步驟之一，如果裂解時(shí)間過(guò)短，會(huì)造成裂解不充分，如果酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體因過(guò)度消化而破碎，因此，本研究對(duì)高粱原生質(zhì)體的酶解時(shí)間進(jìn)行探索。研究結(jié)果表明，在裂解1～3 h時(shí)只有少量原生質(zhì)體，裂解7 h時(shí)獲得原生質(zhì)體效率最高(圖2，圖3)，其原生質(zhì)體濃度達(dá)到4.7×106。裂解8 h原生質(zhì)體濃度反而下降，細(xì)胞碎片明顯增加，這可能是由于原生質(zhì)體過(guò)度酶解破裂所造成的。

圖2 不同酶解時(shí)間的處理

2.3 GFP和YFP原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

為檢驗(yàn)原生質(zhì)體質(zhì)量以及轉(zhuǎn)化效率，采用氯化銫密度梯度離心法提取高純度的PYBA-GFP和PYBA-YFP質(zhì)粒，取2μg質(zhì)粒用40% PEG進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后室溫靜置12 h后，用激光共聚焦顯微鏡分別在488 nm和514 nm激光波長(zhǎng)下觀察GFP和YFP熒光信號(hào)。從本實(shí)驗(yàn)可以看出，GFP(圖4 A)和YFP(圖4 B)在整個(gè)原生質(zhì)體中都有表達(dá)，并且信號(hào)非常強(qiáng)，說(shuō)明質(zhì)粒的質(zhì)量以及轉(zhuǎn)化效率都非常好。

圖3 獲得的高粱原生質(zhì)體

3 結(jié)論與討論

利用原生質(zhì)體對(duì)植物基因功能進(jìn)行研究已經(jīng)成為植物基因功能研究最常用手段之一。植物懸浮細(xì)胞或者愈傷組織是常用于制備原生質(zhì)體的材料，但制備懸浮細(xì)胞和愈傷組織費(fèi)時(shí)費(fèi)力，衛(wèi)志明等[9]報(bào)道的高粱備原生質(zhì)體方法，采用的是懸浮細(xì)胞為材料，期間每周繼代 培養(yǎng)1次，持續(xù) 2個(gè)月才得到高粱懸浮細(xì)胞，非常耗時(shí)耗力。本研究采用高粱幼苗為材料，克服了上述缺點(diǎn)。

研究表明，選用黃化苗比選用正常生長(zhǎng)的幼苗制備原生質(zhì)體產(chǎn)量要低，這可能是由于幼苗經(jīng)過(guò)避光培養(yǎng)，植株會(huì)加速生長(zhǎng)從而進(jìn)一步影響其細(xì)胞形態(tài)，也有可能暗培養(yǎng)導(dǎo)致其細(xì)胞成分發(fā)生變化，并最終影響酶解效率[11-12]。本研究采用黃化苗制備原生質(zhì)體是考慮后期進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究時(shí)去除葉綠體自發(fā)熒光的干擾問(wèn)題，這也是水稻等植物常采用的方法。

圖4 GFP/YFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體

在原生質(zhì)體制備環(huán)節(jié)中，酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量的重要因素之一，因此本研究分析了不同酶解時(shí)間處理，最終所獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量，得出7 h處理為最佳處理時(shí)間。但原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化影響其效率的因素還有很多，比如PEG分子量、PEG生產(chǎn)廠家、其它不同酶的組合等等[13-14]，這些都需要今后進(jìn)一步研究和完善。