注射熱休克蛋白促進(jìn)劑或抑制劑后異育銀鯽感染CyHV-2時(shí)生理狀態(tài)的響應(yīng)

董華雨,陳勝峰,吳萍,稅典章,許凡,高璐

摘要：鑒于異育銀鯽鰓出血病與溫度相關(guān)的發(fā)病特征，分別對(duì)異育銀鯽注射HSP70抑制劑和促進(jìn)劑進(jìn)行了其體內(nèi)熱休克蛋白的人工干預(yù)。研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖池塘自然發(fā)病的具有鰓出血病典型癥狀的異育銀鯽，其肝臟內(nèi)HSP70基因的表達(dá)量與健康異育銀鯽相比明顯升高，人工感染CyHV-2病毒后，肝臟內(nèi)HSP70表達(dá)量在24h后顯著增加，當(dāng)魚(yú)體表現(xiàn)出發(fā)病癥狀時(shí)，HSP70表達(dá)量極顯著上升。對(duì)照組在人工感染CyHV-2后，血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在魚(yú)體發(fā)病時(shí)顯著升高，且在發(fā)病時(shí)與注射促進(jìn)劑和抑制劑組都有極顯著差異;注射HSP70促進(jìn)劑組在人工感染CyHV-2后，血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在12h時(shí)顯著升高。注射HSP70抑制劑的異育銀鯽體內(nèi)病毒數(shù)在感染病毒后12h時(shí)，就達(dá)到最高點(diǎn)，明顯高于對(duì)照組及注射促進(jìn)劑組的同時(shí)間段病毒數(shù)。說(shuō)明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的積極作用。

關(guān)鍵詞：異育銀鯽，熱休克蛋白，CyHV-2，谷氨酰胺，槲皮素

中圖分類(lèi)號(hào)：S94 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

鰓出血病是異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）因感染鯉Ⅱ型皰疹病毒（CyHV-2）而致的一種疾病，初期病魚(yú)表現(xiàn)為食欲減退，離群獨(dú)游，后期則表現(xiàn)為鰓部出血，胸部、腹部有出血點(diǎn)，腹部腫脹，尾鰭、背鰭明顯發(fā)白。鰓出血病常在5月、6月、10月、11月水體溫度在15℃～25℃時(shí)爆發(fā)，當(dāng)水溫高于30℃及低于15℃時(shí)都會(huì)停止發(fā)病[1]，說(shuō)明魚(yú)體?？梢詳y帶病毒生存。因此，異育銀鯽鰓出血病的發(fā)病過(guò)程，除了從病原體（病毒）角度考慮是否是因15℃～25℃溫度適宜病毒增殖外，魚(yú)體內(nèi)自身與溫度高低相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)也可作為關(guān)注的焦點(diǎn)。

熱休克蛋白是生物體在應(yīng)激條件下，如饑餓、高溫、缺氧、感染等狀態(tài)下在體內(nèi)高效表達(dá)的一類(lèi)蛋白質(zhì)。其中，熱休克蛋白70（HSP70）是一種細(xì)胞保護(hù)蛋白，也是主要的分子伴侶蛋白之一。HSP70還能參與免疫復(fù)合物的形成，加強(qiáng)抗原提呈[2]，并能在體內(nèi)誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答[3]。在對(duì)水生動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，凡濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的HSP70可與白斑綜合征病毒（WSSV）的結(jié)構(gòu)蛋白VP24、VP26相互作用，VP24、VP26可降低HSP70的ATPase活性[4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)體內(nèi)HSP70在感染CyHV-2后顯著上調(diào)，說(shuō)明HSP70在鰓出血病的發(fā)生中也起著一定的作用。由此可見(jiàn)，HSP70的研究，是一條很好地開(kāi)展異育銀鯽鰓出血病發(fā)生機(jī)制研究的途徑。反之，如果通過(guò)人工干預(yù)，降低或增高魚(yú)體內(nèi)的熱休克蛋白含量，是否也會(huì)對(duì)魚(yú)體內(nèi)的病毒作用產(chǎn)生抑制或促進(jìn)效應(yīng)。因此，基于這樣的設(shè)想，本文通過(guò)給魚(yú)體注射HSP70促進(jìn)劑或抑制劑，然后人工感染CyHV-2，研究了魚(yú)體在人為地提高或降低體內(nèi)熱休克蛋白、并感染CyHV-2情況下的生理響應(yīng)，以期為闡明異育銀鯽鰓出血病發(fā)生機(jī)制提供有效的基礎(chǔ)資料，為異育銀鯽抗CyHV-2的藥物或飼料開(kāi)發(fā)提供有力的依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

健康的異育銀鯽購(gòu)自蘇州市南環(huán)批發(fā)市場(chǎng)，共225尾。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后暫養(yǎng)于曝氣后的水中，經(jīng)部分抽檢，確證未感染CyHV-2病毒。發(fā)病的異育銀鯽具有典型的鰓出血病癥狀，取自江蘇大豐。病魚(yú)的內(nèi)臟取出后放于-80℃保存。斛皮素和谷氨酰胺分別購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?異育銀鯽CyHV-2的人工感染

將異育銀鯽隨機(jī)分為3組，分別為HSP70促進(jìn)組、HSP70抑制組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放置30尾異育銀鯽。HSP70抑制組每尾異育銀鯽以5 mg/kg劑量于背鰭后方注射槲皮素，HSP70促進(jìn)組每尾異育銀鯽以0.75g/kg劑量于背鰭后方注射谷氨酰胺，對(duì)照組注射相同體積的0.65%的滅菌生理鹽水。均分兩次間隔4小時(shí)注射。取患病異育銀鯽的內(nèi)臟組織按1﹕6（w/v）0.65%滅菌生理鹽水制作組織勻漿，-80℃至室溫反復(fù)凍融3次，5000 rpm離心10 min，所得上清液過(guò)0.45 μm濾膜除菌后，收集濾液置于4℃?zhèn)溆肹5]。將病毒液按每尾魚(yú)0.3 mL/尾的劑量進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組每尾注射0.3 mL生理鹽水。病毒液于分別注射槲皮素和谷氨酰胺后24小時(shí)注射。注射槲皮素和谷氨酰胺后12小時(shí)采樣，樣品記為0 h，即為感染CyHV-2前樣本。

分別于注射病毒液后12 h，24 h，48 h，72 h和異育銀鯽已有明顯腹部腫脹、鰓部出血的癥狀時(shí)采樣。取肝臟、脾臟和腎臟組織，在DEPC水配制的PBS中漂洗后，經(jīng)液氮冷凍后，于-80℃保存。

1.2.2 ?血清生化指標(biāo)的測(cè)定

對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組異育銀鯽進(jìn)行尾靜脈采血，4℃ 3500 r/min離心10分鐘，收集血清，于美國(guó)雅培c8000全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測(cè)定。

1.2.3 ?異育銀鯽不同生理狀態(tài)下體內(nèi)HSP70的表達(dá)差異

采集經(jīng)過(guò)PCR鑒定檢出CyHV-2陽(yáng)性并具有明顯鰓出血病癥狀的異育銀鯽肝臟，在DEPC水配制的PBS中漂洗后，經(jīng)液氮冷凍后，于-80℃保存。未檢出CyHV-2的健康異育銀鯽用同樣的方法采集組織樣品。各組織于液氮中研磨，進(jìn)行總RNA的提取，并反轉(zhuǎn)成cDNA第一鏈。以本實(shí)驗(yàn)室異育銀鯽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的數(shù)據(jù)庫(kù)中一條注釋為HSP70的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)引物，以肝臟cDNA為模板進(jìn)行克隆，以所獲序列設(shè)計(jì)特異引物F：GGAGTCCTACGCCTTCAACA和R：TTGCAGACCTTCTCCAGCTC，以異育銀鯽β-actin基因序列（MF463002）設(shè)計(jì)內(nèi)參引物F： TGTCCCTGTATG CCTCTGGT和R： TGTAGCCTCTCTCGGTCAGG，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。進(jìn)行Real-time熒光定量PCR，反應(yīng)結(jié)果用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析[6]。用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 ?注射HSP70抑制劑和促進(jìn)劑的異育銀鯽人工感染CyHV-2后體內(nèi)病毒數(shù)的測(cè)定

根據(jù)CyHV-2病毒編碼解旋酶序列（KM200722.1）設(shè)計(jì)引物F：ATGTGCAACGTGACGGCGAGT和 R：CTACCGTCTTTTAGGG，以病魚(yú)DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將特異條帶克隆入DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定后提取質(zhì)粒，并計(jì)算每毫升溶液中質(zhì)?？截悢?shù)。根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)Real-time熒光定量PCR引物F： TGGAATCAGTTCAACGCGTCAT和 ?R： CGTCAGTGCCTGGCAG TAATA，將所得質(zhì)粒從102-108按10倍梯度稀釋?zhuān)Y(jié)合熒光定量PCR數(shù)據(jù)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程[7]。

分別取一定量的注射生理鹽水、槲皮素或谷氨酰胺并人工感染CyHV-2后的異育銀鯽內(nèi)臟，經(jīng)快速提取DNA后，取2微升進(jìn)行Real-time熒光定量PCR，根據(jù)Ct值計(jì)算組織中的病毒拷貝數(shù)。所得數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，在單因素方差分析的基礎(chǔ)上，采用Duncan氏多重比較法檢驗(yàn)組間差異（P=0.05）。

2 ?結(jié)果

2.1 ?異育銀鯽感染CyHV-2后HSP70的表達(dá)變化

養(yǎng)殖池塘自然發(fā)病的具有鰓出血病典型癥狀的異育銀鯽，其肝臟內(nèi)HSP70基因的表達(dá)量與健康異育銀鯽相比明顯地升高（P<0.01）（圖1）。人工感染CyHV-2病毒后，肝臟內(nèi)HSP70表達(dá)量在24h后顯著增加（P<0.05），隨后趨于正常;而當(dāng)魚(yú)體表現(xiàn)出發(fā)病癥狀時(shí)，HSP70表達(dá)量極顯著上升（P<0.01）（圖2）。自然發(fā)病和人工感染CyHV-2發(fā)病的異育銀鯽體內(nèi)HSP70表達(dá)量的顯著升高說(shuō)明HSP70與鰓出血病之間存在著一定的關(guān)系。

2.2 ?注射HSP70抑制劑、促進(jìn)劑并人工感染CyHV-2后異育銀鯽血清中生化指標(biāo)的變化

對(duì)照組在人工感染CyHV-2后，血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量在72h內(nèi)相對(duì)平穩(wěn)，在魚(yú)體發(fā)病時(shí)顯著升高（P<0.05），且在發(fā)病時(shí)與注射促進(jìn)劑和抑制劑組都有極顯著差異（P<0.01）。注射HSP70促進(jìn)劑組在人工感染CyHV-2后，血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量在12時(shí)顯著升高（P<0.05），后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，至發(fā)病時(shí)已和感染病毒前持平。注射HSP70抑制劑組在人工感染CyHV-2后，血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量在12時(shí)開(kāi)始升高，至24h達(dá)最高值（P<0.05），后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，至發(fā)病時(shí)已和感染病毒前持平（圖3）。

對(duì)照組在人工感染CyHV-2后，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量在12 h時(shí)略有下降，24 h時(shí)略升高，48 h后又下降直至發(fā)病都很平穩(wěn)，但幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量和感染前相比都無(wú)顯著差異。注射HSP70促進(jìn)劑組在人工感染CyHV-2后，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量在12h時(shí)顯著升高（P<0.05），后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，至發(fā)病時(shí)已和感染病毒前持平。注射HSP70抑制劑組在人工感染CyHV-2后，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量在12時(shí)開(kāi)始升高并達(dá)最高值，后逐漸下降并趨于穩(wěn)定，但和感染前相比同樣無(wú)顯著差異（圖4）。

2.3 ?注射HSP70抑制劑、促進(jìn)劑并人工感染CyHV-2后異育銀鯽體內(nèi)的CyHV-2病毒數(shù)量

將含有病毒核酸的質(zhì)粒從102-108按10倍梯度稀釋后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值獲得了線性回歸方程：y= -3.4789x +37.507，R2為0.99816。注射HSP70促進(jìn)劑、抑制劑的異育銀鯽人工感染CyHV-2后，對(duì)其體內(nèi)的病毒拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)注射HSP70抑制劑的異育銀鯽體內(nèi)病毒數(shù)在感染病毒后12 h時(shí)，就達(dá)到最高點(diǎn)，約為剛感染時(shí)的9倍（P<0.01），明顯高于對(duì)照組及注射HSP70促進(jìn)劑組的同時(shí)間段病毒數(shù)（P<0.01）;隨后病毒數(shù)有所下降，但是至發(fā)病時(shí)，仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于感染初期。而對(duì)照組和注射HSP70促進(jìn)劑組，在病毒的增殖趨勢(shì)及數(shù)量上，兩者都沒(méi)有明顯差異（圖5）?？梢?jiàn)當(dāng)異育銀鯽體內(nèi)的熱休克蛋白被人為抑制時(shí)，魚(yú)體對(duì)CyHV-2病毒的抵御能力大大下降，從而CyHV-2病毒得以在異育銀鯽體內(nèi)大量增殖，說(shuō)明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的積極作用。

3 ?討論

熱休克蛋白是生物體在應(yīng)激條件下在體內(nèi)高效表達(dá)的一類(lèi)蛋白質(zhì)，也是一種細(xì)胞保護(hù)蛋白。熱休克蛋白能抑制產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶，并且能直接釋放或增加細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶等抗氧化劑，從而使生物體具有更好的抗應(yīng)激能力[8，9]。在池塘自然感染CyHV-2病毒后患病的異育銀鯽體內(nèi)，HSP70在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量為正常值的7倍，而在人工感染CyHV-2后，在鰓出血病的急性爆發(fā)期，病魚(yú)體內(nèi)的HSP70 mRNA表達(dá)量更是驚人地高出對(duì)照組100多倍。說(shuō)明異育銀鯽在感染CyHV-2后，為增強(qiáng)機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)HSP基因的表達(dá)大量增強(qiáng)，以減少機(jī)體因感染病毒受到的損害。由于HSP70還能參與免疫復(fù)合物的形成，在體內(nèi)誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答[3]。因此，異育銀鯽在感染CyHV-2并發(fā)病后，機(jī)體為了盡快產(chǎn)生免疫復(fù)合物來(lái)防御入侵的病原，調(diào)動(dòng)了體內(nèi)HSP70基因的大量表達(dá)。兩者疊加，造成了HSP70在表達(dá)水平的顯著升高。而人工感染后的發(fā)病魚(yú)體，其體內(nèi)的HSP70 mRNA 要遠(yuǎn)高于池塘自然發(fā)病的個(gè)體，推測(cè)因?yàn)槿斯じ腥九c自然傳播相比，用的劑量更大，病毒復(fù)制數(shù)目更多，發(fā)病的時(shí)間更短。

谷氨酰胺（Glutamine）是一種極有潛力的熱休克蛋白誘導(dǎo)劑，因其可誘導(dǎo)增強(qiáng)HSP70的表達(dá)，已在藥物開(kāi)發(fā)中得到了一定的應(yīng)用[10，11]，而槲皮素（Quercetin）具有抑制熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄與翻譯的功能[12-14]。在已知CyHV-2感染異育銀鯽能提高魚(yú)體內(nèi)HSP70基因的表達(dá)后，分別通過(guò)給魚(yú)體注射谷氨酰胺和槲皮素來(lái)提高或阻斷體內(nèi)的HSP70，并人工感染CyHV-2，通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)魚(yú)體內(nèi)病毒拷貝數(shù)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)HSP70與CyHV-2病毒的增殖間有密切的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)注射槲皮素的異育銀鯽體內(nèi)病毒數(shù)在感染病毒后12h時(shí)，就達(dá)到最高點(diǎn)，約為剛感染時(shí)的9倍，明顯高于對(duì)照組及注射谷氨酰胺組異育銀鯽的同時(shí)間點(diǎn)病毒數(shù);注射槲皮素組的異育銀鯽，體內(nèi)病毒數(shù)在12 h至最高峰后雖然接著有所下降，但是至發(fā)病時(shí)，仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于感染初期?？梢?jiàn)當(dāng)異育銀鯽體內(nèi)的熱休克蛋白被人為減少時(shí)，魚(yú)體對(duì)CyHV-2病毒的抵御能力大大下降，從而CyHV-2病毒得以在異育銀鯽體內(nèi)大量增殖，說(shuō)明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的積極作用。人工增加或減少魚(yú)體內(nèi)的HSP70，在相同的人工感染CyHV-2的條件下，魚(yú)體內(nèi)病毒的拷貝數(shù)有不同的呈現(xiàn)，這也解釋了CyHV-2引起的疾病常在水溫15℃～25℃發(fā)病的原因。水溫15℃～25℃，是異育銀鯽最適宜的生長(zhǎng)溫度，在此溫度下，因溫度刺激產(chǎn)生的應(yīng)激最小，體內(nèi)熱休克蛋白的量處于一個(gè)相對(duì)低的水平，因此，當(dāng)魚(yú)體感染CyHV-2時(shí)，對(duì)病毒的抵御能力較差，病毒增殖迅速，打破了機(jī)體自身與病毒造成損傷之間的平衡，鰓出血病往往容易爆發(fā)。而當(dāng)水溫高于25℃或低于15℃時(shí)，水溫本身對(duì)魚(yú)體已經(jīng)產(chǎn)生了刺激，魚(yú)體內(nèi)熱休克蛋白量有所增加，從而促進(jìn)魚(yú)體免疫復(fù)合物的形成，對(duì)病毒的增殖起了一定的抑制作用。所以即使魚(yú)體感染了CyHV-2，往往也能攜帶病毒生存，不會(huì)造成鰓出血病的大規(guī)模爆發(fā)。

血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）可反映肝細(xì)胞損傷的程度。肝臟承擔(dān)著魚(yú)體糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和維生素等物質(zhì)的代謝，當(dāng)機(jī)體受到致病因子的侵害時(shí)，肝臟的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到不同程度的損害，并引起相應(yīng)的代謝物紊亂[15]。劉文枝等的研究表明，異育銀鯽在人工感染CyHV-2后，血清中AST的含量會(huì)有顯著升高[5]，本研究也得到了相似的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組在人工感染CyHV-2后，血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在魚(yú)體發(fā)病時(shí)顯著升高，且在發(fā)病時(shí)與注射HSP70促進(jìn)劑和抑制劑組都有極顯著差異。注射HSP70促進(jìn)劑和抑制劑組，血清中AST含量和感染CyHV-2前相比，并沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明人為地對(duì)異育銀鯽體內(nèi)的HSP70進(jìn)行干預(yù)后，對(duì)因病毒造成的肝臟損傷產(chǎn)生了一定的拮抗，在一定程度上對(duì)機(jī)體起到了保護(hù)作用。相比之下，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶僅在注射HSP70促進(jìn)劑組在人工感染CyHV-2后12 h時(shí)顯著升高，其他均無(wú)顯著差異。因此，血清中天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的數(shù)值可作為異育銀鯽鰓出血病輔助判別的血清指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]吳霆，丁正峰，朱春艷，薛中儀，顧偉，孟慶國(guó)，王文。異育銀鯽鰓出血病流行病學(xué)調(diào)查和研究。水產(chǎn)科學(xué)，2014，33（5）：283-287.

[2] 楊瑞，馮作化，張桂梅，等，重組人HSP70的制備及其提呈抗原作用的研究，2001，藥物生物技術(shù)，2001，8（5）：244-247.

[3] Anne-marie T C ， Max P， Carey L O， et al .Immunization with a lymphocytic choriomeningitis virus peptide mixed with heat shock protein 70 results in protective antiviral immunity and specific cytotoxic T lymphocytes[J]. J Exp Med， 1998 ， 187：685

[4] 孫凡. 凡納濱對(duì)蝦熱休克蛋白60、70和90與WSSV的相互作用[D]. 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013：43-48.

[5] 劉文枝， 曾令兵， 張輝， 等. 2013. 異育銀鯽感染鯉皰疹病毒Ⅱ型（ Cy HV-2）后血液生理生化指標(biāo)變化的研究[A]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 22（6）： 928-935.

[6] Livak K J， Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 （delta delta C（T）） method[J]. Methods， 25：402-408.

[7] 謝亞君，稅典章，吳萍，等.基于不同PCR方法的Ⅱ型鯉皰疹病毒檢測(cè)技術(shù)研究[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2019，38（3）：1018-1025.

[8] 崔彥婷，劉波，謝駿，等。熱休克蛋白研究進(jìn)展及其在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究前景。[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（3）：303-306.

[9] 陳明帥，徐超，宋興超，熱休克蛋白的研究進(jìn)展。經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2016，20（1）：44-53.

[10] 孫培明。谷氨酰胺對(duì)熱休克蛋白70的誘導(dǎo)及其抗應(yīng)激作用。山東畜牧獸醫(yī)，2011，132（6）：77-79

[11] Wischmeyer PE. Glutamine and heat shock protein expression [J]. Nutrition， 2002， 18 （3）：225-228.

[12] Nakanoma T， M Ueno， M Iida， et al. Effects of quercetin on the heat-induced cytotoxicity of prostate cancer cells [J]. Int J Urol， 2001， 8：623-630.

[13] Nagai N， Nakai A， Nagata K， et al. Quercetin suppresses heat shock response by down regulation of HSF1 [J]. Biochem Biophys Res Commun， 1995， 208：1099-1105.

[14] Mitsuhiro F， Masami N， Mickio M， et al. Synegistic cytotoxic effect of quercetin and heart treatment in a lymphoid cell line （OZ） with low HSP70 expression [J]. Leukemia Res， 1997， 21 （2）：139-143.

[15] 卓樹(shù)洪，葉曉光，馮桂玲，等。天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶比值與天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶-血小板比值在HBV感染相關(guān)疾病中的臨床應(yīng)用。中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2015，21 （5）：432-435.