鉤藤生物堿的組織化學(xué)定位研究

闕云飛 王曉紅 呂享 李雪 楊勝偉 徐佳瑜 張明生

摘 要：利用石蠟切片、組織化學(xué)定位及生物堿含量測(cè)定技術(shù)，研究了鉤藤營(yíng)養(yǎng)器官的組織結(jié)構(gòu)、總生物堿分布及含量。結(jié)果表明，鉤藤根的次生結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，韌皮射線呈明顯的喇叭口狀;莖中維管射線排列整齊;葉片葉肉細(xì)胞分化為柵欄組織和海綿組織，葉脈次生結(jié)構(gòu)不發(fā)達(dá);鉤是由枝變態(tài)發(fā)育而來(lái)，解剖結(jié)構(gòu)與莖相同。鉤藤生物堿的組織化學(xué)定位顯示，鉤藤全株均有生物堿分布，根中主要分布在次生韌皮部及次生木質(zhì)部，莖和鉤中主要分布在韌皮部和木質(zhì)部及皮層薄壁細(xì)胞，葉中主要分布在韌皮部和木質(zhì)部及葉肉細(xì)胞。鉤藤生物堿含量以莖最高，根、葉片及鉤次之。鉤藤營(yíng)養(yǎng)器官總生物堿的組織化學(xué)定位研究，可為該資源的充分開發(fā)利用總生物堿奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鉤藤;營(yíng)養(yǎng)器官;生物堿;組織化學(xué)定位;含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：Q945.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）03-0027-06 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.006

Abstract：The structure of vegetative organs of Uncaria rhynchophylla，as well as total alkaloid content and distribution，were studied by paraffin sectioning，histochemical localization，and alkaloid content determination technique. The results showed that the secondary structure of U. rhynchophylla was well developed，and the phloem rays were obviously trumpet-like. The vascular ray in the stem was neatly arranged. The mesophyll cells of the leaves were differentiated into palisade tissue and sponge tissue，and the secondary veins were underdeveloped. The hook was metamorphosed from the branch and had the same anatomy as the stem. The histochemical localization of U. rhynchophylla alkaloids showed that alkaloids were distributed in the whole plant，and in the root，it was mainly distributed in the secondary phloem and secondary xylem. The alkaloids were distributed in the phloem，xylem and cortical parenchyma cells in the stems and hooks，while distributed in phloem，xylem and mesophyll cells in the leaves. The alkaloid content of U. rhynchophylla was the highest in stems，followed by roots，leaves and hooks. The histochemical localization of total alkaloids in the vegetative organs of U. rhynchophylla may lay a theoretical and technical foundation for the full development and utilization of this resource.

Key words：Uncaria rhynchophylla; vegetative organs; alkaloids; histochemistry localization; content determination

鉤藤（Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq. ex Havil.）為茜草科（Rubiaceae）鉤藤屬（Uncaria Schreber）多年生木質(zhì)藤本植物，以干燥帶鉤莖枝入藥。其味甘，性凉，歸肝，心包徑，有息風(fēng)定驚、清熱平肝等功效;用于肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、驚癇抽搐、高熱驚厥、感冒夾驚、小兒驚啼、妊娠子癇及頭痛眩暈等癥[1]。鉤藤中主要藥效成分為吲哚類生物堿，包括鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、柯諾辛堿、柯南因堿等百余種，其中以鉤藤堿和異鉤藤堿含量較高[2-4]。目前，有關(guān)鉤藤的研究主要集中在種植技術(shù)、成分分析及藥理作用等方面[5-10]，而對(duì)其生物堿積累至關(guān)重要的營(yíng)養(yǎng)器官結(jié)構(gòu)及組織化學(xué)定位研究未見報(bào)道。本文以三年生鉤藤為實(shí)驗(yàn)材料，采用石蠟切片、組織化學(xué)定位及生物堿含量測(cè)定技術(shù)，探究其營(yíng)養(yǎng)器官的組織結(jié)構(gòu)及總生物堿在不同器官中的分布情況，以期為該物種資源的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

實(shí)驗(yàn)材料取自貴州省黔東南州鉤藤種植基地的三年生鉤藤植株，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定為鉤藤Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq. ex Havil.。

1.2 研究方法

1.2.1 組織結(jié)構(gòu)觀察方法

參考楊吉?jiǎng)偟萚11]的方法，略做改動(dòng)。用蒸餾水將新鮮鉤藤樣品洗凈，取大小為5 mm的根、莖、葉、鉤，于FAA固定液（70%乙醇）中固定24 h，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度8 μm）、番紅及固綠染色、中性樹膠封片后，置于OLYMPUS BX 51顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 組織化學(xué)定位

參考包英華等[12]的方法，略做改動(dòng)。取鉤藤根、莖、葉、鉤進(jìn)行徒手切片，用改良碘化鉍鉀（0.85 g 次硝酸鉍溶于10 mL 冰醋酸和 40 mL 蒸餾水中，再與20 mL 40%的碘化鉀混合）處理15 min，再用蒸餾水清洗3次，置于OLYMPUS BX 51顯微鏡下觀察并拍照，改良碘化鉍鉀試劑與生物堿反應(yīng)產(chǎn)生黃色至橘黃色沉淀。為保證染色結(jié)果的準(zhǔn)確性，以濃硝酸作為生物堿染色劑對(duì)照，濃硝酸與生物堿產(chǎn)生橘黃色沉淀;用溴甲酚綠試劑（溴甲酚綠溶液與pH3.6鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液等量混合）作為生物堿染色劑對(duì)照，該試劑與生物堿產(chǎn)生藍(lán)綠色沉淀反應(yīng)。

1.2.3 生物堿含量測(cè)定方法

參考曾常青[13]的方法，略做改動(dòng)。取鉤藤莖、枝、葉片及鉤55℃烘干，磨粉過(guò)40目篩備用;稱取1.0 g鉤藤粉末于錐形瓶中，加入氨溶液（氨水∶蒸餾水∶無(wú)水乙醇=9∶30∶16）潤(rùn)濕30 min，再加入50 mL甲醇，超聲提取40 min，過(guò)濾后55℃水浴蒸干甲醇，加入30 mL pH 3.6鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液（0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液25 mL與0.1 mol/L鹽酸6 mL混合，加蒸餾水稀釋至100 mL），搖勻并過(guò)濾，緩沖劑定容到50 mL即為供試液;取供試液4 mL，酸性染料比色法顯色條件為10 mL pH 3.6鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液，10 mL溴甲酚綠溶液（0.1g溴甲酚綠溶于2.8 mL 0.05 mol/L NaOH溶液中，蒸餾水定容至200 mL），三氯甲烷萃取3次，每次4 mL，定容至25 mL，加入1.0 g無(wú)水硫酸鈉，紫外分光光度計(jì)413 nm下測(cè)定OD值（表示為A413=Abs）;以鉤藤堿為對(duì)照品，用甲醇制成43.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其在43.2～259.2 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程為：C=0.0431A+0.0199，R2=0.998;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中鉤藤生物堿含量（以鉤藤堿計(jì)）。數(shù)據(jù)分析和繪圖利用Excel 2016與SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉤藤營(yíng)養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)

2.1.1 根的結(jié)構(gòu)

鉤藤根橫切面結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)分別為：周皮及維管柱（圖1-1）。周皮最外層為木栓層，細(xì)胞壁栓質(zhì)化程度高，呈規(guī)則長(zhǎng)方形;周皮細(xì)胞不透氣、不透水、排列緊密，為鉤藤根的次生保護(hù)結(jié)構(gòu)。次生韌皮部位于初生韌皮部的內(nèi)側(cè)，且次生韌皮部的生長(zhǎng)將初生韌皮部擠碎，此時(shí)同化產(chǎn)物的運(yùn)輸主要由次生韌皮部承擔(dān)，次生韌皮部中韌皮射線呈明顯的喇叭口狀;次生木質(zhì)部位于初生木質(zhì)部外側(cè)，初生木質(zhì)部被擠到根中心，次生木質(zhì)部中包含木射線及導(dǎo)管，無(wú)髓部。

2.1.2 莖的結(jié)構(gòu)

鉤藤莖橫切面結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)分別為：表皮、皮層和維管柱（圖1-2）。表皮由一層排列整齊、緊密的細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞形狀為規(guī)則方形。皮層由數(shù)層薄壁細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞間隙較大、細(xì)胞體積大。維管形成層中紡錘狀原始細(xì)胞向外分裂分化形成了次生韌皮部，射線原始細(xì)胞向外分裂分化形成了韌皮射線，此時(shí)初生韌皮部被不斷生長(zhǎng)的次生韌皮部擠碎，難以辨別;同時(shí)紡錘狀原始細(xì)胞向內(nèi)分裂分化形成次生木質(zhì)部導(dǎo)管和管胞，位于初生木質(zhì)部?jī)?nèi)側(cè)，射線原始細(xì)胞向內(nèi)分裂分化形成木射線;維管柱中還包含髓射線，它是連接皮層與髓的薄壁組織;莖中央為薄壁細(xì)胞，其細(xì)胞體積大，主要起儲(chǔ)藏作用。

2.1.3 葉的結(jié)構(gòu)

鉤藤葉片橫切面結(jié)構(gòu)主要由表皮、葉肉細(xì)胞和葉脈組成（圖1-3）。表皮為上下葉面最外一層，由排列整齊、緊密的方形細(xì)胞構(gòu)成。柵欄組織緊貼上表皮，由兩層長(zhǎng)圓柱狀薄壁細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞間隙較小，含有大量葉綠體，為葉片中主要的光合區(qū)域;海綿組織位于下表皮內(nèi)側(cè)，海綿組織細(xì)胞間隙大，同時(shí)含有少量葉綠體。葉脈由厚角組織、薄壁組織和維管束組成;厚角組織和薄壁組織位于表皮內(nèi)側(cè)，薄壁組織包圍在維管束外形成維管束鞘;葉脈中維管束主要由木質(zhì)部、韌皮部和束中形成層構(gòu)成，木質(zhì)部近上表皮，韌皮部近下表皮，屬于無(wú)限維管束類型，可看作莖中維管束的延伸，束中形成層分裂能力弱、分裂時(shí)間短，只形成極少的次生結(jié)構(gòu)。

2.1.4 鉤的結(jié)構(gòu)

鉤藤的鉤是由枝變態(tài)發(fā)育而來(lái)（圖1-4）。鉤的解剖結(jié)構(gòu)與莖相同，主要由表皮、皮層和維管柱構(gòu)成。

2.2 鉤藤生物堿組織化學(xué)定位

2.2.1 根中生物堿的分布

鉤藤根徒手切片經(jīng)改良碘化鉍鉀試劑處理后，在次生韌皮部及次生木質(zhì)部出現(xiàn)了橘黃色沉淀，次生韌皮部橘黃色沉淀較多，周皮未出現(xiàn)橘黃色沉淀（圖2-1）。用溴甲酚綠試劑處理鉤藤根部切片，在次生韌皮部及次生木質(zhì)部中出現(xiàn)藍(lán)綠色沉淀，在次生木質(zhì)部中產(chǎn)生的藍(lán)綠色沉淀較少（圖2-5）。切片經(jīng)濃硝酸處理后，次生韌皮部及次生木質(zhì)部出現(xiàn)了橘黃色沉淀（圖2-9）。改良碘化鉍鉀試劑、溴甲酚綠試劑與濃硝酸的染色結(jié)果基本一致，說(shuō)明次生韌皮部與次生木質(zhì)部為總生物堿在鉤藤根中的主要分布部位。

2.2.2 莖中生物堿的分布

鉤藤莖徒手切片經(jīng)改良碘化鉍鉀試劑處理后，在韌皮部和木質(zhì)部及皮層出現(xiàn)了大量橘黃色沉淀，靠近形成層部分的橘黃色沉淀較多、顏色較深，靠近薄壁細(xì)胞的部分橘黃色沉淀較少、顏色較淺（圖2-2）。用溴甲酚綠試劑處理切片，韌皮部和木質(zhì)部以及皮層中出現(xiàn)大量藍(lán)綠色沉淀（圖2-6）。濃硝酸處理切片后，在韌皮部和木質(zhì)部，以及皮層細(xì)胞出現(xiàn)了橘黃色沉淀（圖2-10）。

（Sx-次生木質(zhì)部;Vc-形成層;Sp-次生韌皮部;E-表皮;Pa-薄壁組織;St-海綿組織;Pt-柵欄組織;P-韌皮部;X-木質(zhì)部;C-皮層;Pe-周皮;Pc-維管柱鞘;Pr-韌皮射線;Xr-木射線;Px-初生木質(zhì)部;Pp-初生韌皮部;V-導(dǎo)管; Py-髓射線;Ch-葉綠體;Co-厚角組織;1：根結(jié)構(gòu)×100;2：莖結(jié)構(gòu)×100;3：葉結(jié)構(gòu)×200;4：鉤結(jié)構(gòu)×100）

2.2.3 葉片中生物堿的分布

鉤藤葉片徒手切片經(jīng)改良碘化鉍鉀試劑處理后，韌皮部和木質(zhì)部出現(xiàn)大量橘黃色沉淀，靠近形成層部分的橘黃色沉淀較多、顏色較深;在柵欄組織中有大量葉綠體存在，增強(qiáng)顯微鏡光源亮度后，能觀察到柵欄組織有橘黃色沉淀產(chǎn)生;連接?xùn)艡诮M織與維管束的部分薄壁細(xì)胞也產(chǎn)生了橘黃色沉淀，該部分的薄壁細(xì)胞是韌皮部裝載的重要組成部分（圖2-3）。溴甲酚綠試劑處理切片后，在葉肉細(xì)胞及韌皮部和木質(zhì)部都產(chǎn)生了大量藍(lán)綠色沉淀（圖2-7）;切片經(jīng)濃硝酸處理后，在韌皮部和木質(zhì)部及葉肉細(xì)胞出現(xiàn)了橘黃色沉淀（圖2-11）。改良碘化鉍鉀試劑、溴甲酚綠試劑與濃硝酸的染色結(jié)果基本一致，說(shuō)明韌皮部和木質(zhì)部以及葉肉細(xì)胞是葉片中總生物堿的分布部位。

2.2.4 鉤中生物堿的分布

鉤藤鉤徒手切片經(jīng)改良碘化鉍鉀試劑處理后，在韌皮部和木質(zhì)部以及皮層細(xì)胞出現(xiàn)了大量的橘黃色沉淀，部分髓部薄壁細(xì)胞出現(xiàn)少量藍(lán)紫色淀粉粒;鉤的組織結(jié)構(gòu)與莖相同，但維管組織沒有莖發(fā)達(dá)，尤其是產(chǎn)生橘黃色沉淀后，對(duì)韌皮部結(jié)構(gòu)的觀察增加了難度（圖2-4）。溴甲酚綠試劑處理切片后，韌皮部和木質(zhì)部以及皮層細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)綠色沉淀（圖2-8）;切片經(jīng)濃硝酸處理后，在韌皮部和木質(zhì)部出現(xiàn)了橘黃色沉淀，皮層也出現(xiàn)的橘黃色（圖2-12）。改良碘化鉍鉀試劑、溴甲酚綠試劑與濃硝酸的染色結(jié)果基本一致，說(shuō)明韌皮部和木質(zhì)部以及皮層細(xì)胞是鉤中生物堿的主要分布部位。

（A：生物堿沉淀;SG：淀粉粒;1：根內(nèi)橘黃色沉淀×100;2：莖內(nèi)橘黃色沉淀×100;3：葉內(nèi)橘黃色沉淀×100;4：鉤內(nèi)橘黃色沉淀×200;5：根內(nèi)藍(lán)綠色沉淀×100;6：莖內(nèi)藍(lán)綠色沉淀×100;7：葉內(nèi)藍(lán)綠色沉淀×100;8：鉤內(nèi)藍(lán)綠色沉淀×100;9：根內(nèi)橘黃色沉淀×50;10：莖內(nèi)橘黃色沉淀×100;11：葉內(nèi)橘黃色沉淀×100;12：鉤內(nèi)橘黃色沉淀×100）

2.3 鉤藤生物堿含量測(cè)定

3 結(jié)論與討論

改良碘化鉍鉀是生物堿染色的通用試劑，與生物堿反應(yīng)產(chǎn)生橘黃色到黃色的沉淀，且顏色深淺可作為生物堿含量高低的判斷依據(jù)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鉤藤中生物堿在根、莖、葉及鉤中均有分布，主要分布在韌皮部、木質(zhì)部、皮層薄壁細(xì)胞及葉肉細(xì)胞有生物堿積累，且其總生物堿含量韌皮部>葉肉細(xì)胞>木質(zhì)部>皮層薄壁細(xì)胞。阮俊等[15]利用生物堿測(cè)定方法，檢測(cè)了廣西鉤藤屬植物的總生物堿含量，結(jié)果表明：鉤藤嫩枝、葉片中總生物堿含量呈周期性變化，且6、7、8月份含量最高，隨著生長(zhǎng)環(huán)境的改變，鉤藤中總生物堿含量變化較大，鉤藤屬植物總生物堿含量以大葉鉤藤為最高。羅曉錚等[16]對(duì)菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）葉和根中生物堿進(jìn)行組織化學(xué)定位，其生物堿分布在柵欄組織、海綿組織及根中韌皮部和部分薄壁細(xì)胞，結(jié)果與本研究相近。包英華等[12]對(duì)金釵石斛（Dendrobium nobile）生物堿進(jìn)行組織化學(xué)定位，莖中分布在基本組織中，根中分布在皮層薄壁細(xì)胞，葉片中分布在上下表皮細(xì)胞，結(jié)果與本研究有差異，在不同的植物中，生物堿種類及分布都不盡相同。鉤藤不同營(yíng)養(yǎng)器官生物堿染色結(jié)果均顯示，靠近形成層部分的橘黃色較深，靠近薄壁細(xì)胞的部分橘黃色較淺，并推測(cè)鉤藤生物堿合成與形成層有關(guān)，與李玉萍等[17]對(duì)蛇根木（Rauvolfia serpentine）根部生物堿分布的研究結(jié)果相似。閆晉晉等[18]利用組織化學(xué)定位、熒光觀察及生物堿提取方法，研究烏頭（Aconitum carmichaeli）營(yíng)養(yǎng)器官中生物堿分布及含量變化，結(jié)果表明，烏頭中生物堿主要分布在韌皮部薄壁細(xì)胞、形成層外側(cè)及莖基部皮層內(nèi)側(cè)，各營(yíng)養(yǎng)器官生物堿含量峰值出現(xiàn)在不同月份;不同生物堿種類，其合成部位也不同，煙草（Nicotiana tobacum L.）根部能合成煙堿及莨菪堿;金雞納（Cinchona sp.）種子萌發(fā)過(guò)程中，喹啉類生物堿大量合成，最后積累在幼苗根細(xì)胞中;生物堿是植物抵抗逆境所產(chǎn)生的重要的次生代謝物質(zhì)，當(dāng)煙草葉片損傷后，煙堿通過(guò)木質(zhì)部從根部運(yùn)送到葉片中積累[19-20]。

改良碘化鉍鉀與生物堿反應(yīng)產(chǎn)生橘黃色不溶性鹽或絡(luò)合物，但與植物細(xì)胞內(nèi)某些成分也能發(fā)生沉淀反應(yīng)，所以在生物堿組織化學(xué)試驗(yàn)中通常會(huì)使用多種顯色沉淀試劑。本試驗(yàn)中利用溴甲酚綠試劑在酸性條件下能與生物堿形成藍(lán)綠色絡(luò)合物，以此對(duì)鉤藤各營(yíng)養(yǎng)器官進(jìn)行染色，結(jié)果與改良碘化鉍鉀染色基本一致，同時(shí)溴甲酚綠也作為鉤藤總生物堿含量測(cè)定方法中的重要試劑。在濃硝酸染色中，葉綠體被破壞而產(chǎn)生橘黃色，影響對(duì)生物堿的觀察，通過(guò)增加總生物堿含量測(cè)定對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行佐證，推測(cè)其是否含有生物堿，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可知葉肉細(xì)胞中有生物堿積累。利用常規(guī)石蠟切片技術(shù)對(duì)鉤藤各營(yíng)養(yǎng)器官進(jìn)行結(jié)構(gòu)解剖及分析，再結(jié)合徒手切片進(jìn)行生物堿染色，能夠更加準(zhǔn)確定位生物堿在營(yíng)養(yǎng)器官中的分布。作者擬通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的鉤藤營(yíng)養(yǎng)器官進(jìn)行生物堿組織化學(xué)定位以及總生物堿含量測(cè)定，觀測(cè)生物堿在鉤藤營(yíng)養(yǎng)器官中的積累規(guī)律，進(jìn)一步推測(cè)鉤藤中生物堿合成及運(yùn)輸途徑。

目前，鉤藤主要以帶鉤莖枝入藥，其主莖、葉片均未得到有效利用。雖然有研究表明[21-22]，鉤藤全株均有生物堿分布，但藥材市場(chǎng)一直未打破固有收購(gòu)傳統(tǒng)，致使葉片及主莖一直未得到有效利用，造成資源浪費(fèi)。本研究采用生物堿組織化學(xué)定位的實(shí)驗(yàn)方法，初步探明了鉤藤中生物堿在各營(yíng)養(yǎng)器官中的分布情況，更加直觀的表明了生物堿在鉤藤全株均有分布，為今后鉤藤資源綜合利用提供了有效的證據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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