交聯(lián)殼聚糖微球制備及在酪蛋白糖巨肽分離中的應(yīng)用

徐平　任效東

摘? ?要：酪蛋白糖巨肽主要是κ-酪蛋白通過凝乳酶降解產(chǎn)生的一類含有糖鏈的多肽，90%的酪蛋白糖巨肽都含唾液酸。其具有顯著的生理功能和營養(yǎng)特性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)用藥品和保健食品中。首先采用反向乳液交聯(lián)法制備交聯(lián)殼聚糖微球，經(jīng)過觀察與測定，結(jié)果表明，所制備的殼聚糖微球呈黃色細(xì)粉狀，具有較好的分散性，表面比較光滑。通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)微球大部分呈較好的球形。并且測定交聯(lián)殼聚糖微球的溶脹率為196.64%，含水量為49.15%。然后以D90乳清粉為原料，利用所制備的交聯(lián)殼聚糖微球吸附分離CGMP，制作出殼聚糖微球吸附分離CGMP的動態(tài)吸附過程穿透曲線，結(jié)果表明，吸附流出液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和唾液酸質(zhì)量濃度的變化趨勢基本相同，并且在收集液體積達(dá)到24 mL時，樣品中的蛋白質(zhì)和唾液酸開始發(fā)生穿透，收集液體積達(dá)到64 mL時，基本全部穿透。

關(guān)鍵詞：酪蛋白糖巨肽;反向乳液交聯(lián)法;交聯(lián)殼聚糖微球

酪蛋白糖巨肽（Casein Glycomacropeptide，CGMP）是乳中κ-酪蛋白（κ-CN）上的一個多肽片段，一般是由于凝乳酶切斷κ-酪蛋白的Phe（105）-M et（106）部位形成不溶性的副κ-酪蛋白和可溶性的酪蛋白聚肽（CMP）兩部分，由于CMP中還有很多糖鏈基團(tuán)，因而被稱為糖巨肽。據(jù)報道，CGMP具備多種生物活性的特性，包括對細(xì)菌和病毒的抑制作用，對胃腸道分泌物的抑制作用，促進(jìn)雙歧桿菌的增殖等。

殼聚糖（Chitosan）是由大部分氨基葡萄糖和少量的N-乙?；咸烟峭ㄟ^β-1，4-糖苷鍵連接起來的直鏈多糖，多發(fā)現(xiàn)于海洋無脊椎動物、昆蟲、真菌、酵母菌中。工業(yè)上殼聚糖生產(chǎn)主要是從蝦、蟹的殼或在海洋產(chǎn)業(yè)的豐富廢舊產(chǎn)品中得到[1]。殼聚糖及其衍生物是唯一的堿性天然多糖高分子，可加工成膜、微球等，它具有良好的生物降解性和生物相容性以及無毒、無味等優(yōu)點(diǎn)，在廢水處理，食品、生物制品的分離純化等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2-4]。交聯(lián)殼聚糖的制備方法目前有兩種：一是反相交聯(lián)法[5]，二是滴加成球法[5]。本研究主要是進(jìn)行交聯(lián)殼聚糖微球的制備和特性測定及對殼聚糖微球吸附分離酪蛋白糖巨肽動態(tài)吸附過程穿透曲線的研究。

1? ? 實(shí)驗(yàn)

1.1? 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥90，80 目，青島利中甲殼質(zhì)公司）;新西蘭濃縮乳清蛋白粉D90（34%）;唾液酸試劑盒（美國博世生物技術(shù)有限公司）;雙縮脲蛋白質(zhì)定量試劑盒（北京雷根生物有限公司）;冰乙酸、液體石蠟、司班、聚乙二醇 2000、甲醛、環(huán)氧氯丙烷、石油醚、丙酮、無水乙醇等國產(chǎn)試劑。

1.2? 儀器與設(shè)備

08-2型磁力攪拌器、DK型恒溫水浴鍋、雷磁PHS-3B pH計均為上?？茖W(xué)精密儀器有限公司生產(chǎn);HD-3紫外檢測儀、BSZ-100電子鐘控自動部分收集器、HL-2恒流泵、XWT-S臺式記錄儀、CXG-1層析柜均為上海嘉鵬科技有限公司生產(chǎn);ATY124電子分析天平，日本島津株式會社生產(chǎn);TD4低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn);紫外可見分光光度計，日本島津株式會社生產(chǎn);顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社生產(chǎn)。

1.3? 方法

1.3.1? 交聯(lián)殼聚糖微球的制備

準(zhǔn)確量取5 mL冰乙酸溶于245 mL去離子水中得到2%（v/v）的乙酸溶液，再稱取10 g殼聚糖邊攪拌邊加入到上述乙酸溶液中，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%左右的殼聚糖溶液。放于裝有攪拌器及溫度計的三口燒瓶（1 000 mL）中，具塞。然后加入等體積液體石蠟，約250 mL，常溫下攪拌10 min后升溫到50 ℃，接著加乳化劑司班80數(shù)滴和致孔劑PEG2000（0.5%）約2.5 g，高速攪拌30 min，直到殼聚糖溶液分散成大小適宜的液滴為止。再加入適量甲醛溶液（2%v/v）約20 mL預(yù)交聯(lián)，低速攪拌反應(yīng)30 min。用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為10～11，加入2 mL環(huán)氧氯丙烷溶液使?jié)舛葹?.04 mol/L，在90～100 ℃下低速攪拌交聯(lián)3 h。冷卻后得到的交聯(lián)殼聚糖微球樹脂轉(zhuǎn)移到燒杯，先用石油醚洗滌數(shù)次，洗凈微球中殘留的液體石蠟等有機(jī)溶劑，然后用乙醇和丙酮充分清洗，再在0.5 mol/L鹽酸溶液中攪拌過夜，這樣可以除去未交聯(lián)的殼聚糖，最后再用1 mol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行浸泡，水洗到中性，得到交聯(lián)殼聚糖微球200 mL。

1.3.2? 交聯(lián)殼聚糖微球的性質(zhì)測定

（1）交聯(lián)殼聚糖微球的形態(tài)觀察和粒徑測定。在顯微鏡下觀察殼聚糖微球的整體形貌并拍攝交聯(lián)殼聚糖微球圖像，隨機(jī)選取20個微球，通過顯微測微計法分別測定粒徑，然后計算出平均粒徑[6]。

（2）交聯(lián)殼聚糖微球溶脹率及含水量的測定。用去離子水將微球充分溶脹，再用濾紙吸干表面的水分，測定濕重Ww值，接著在60 ℃下烘干至恒重，然后測定干重Wd值，計算微球的溶脹率及含水量，公式如下：溶脹率=Ww/Wd×100%;含水量=（Ww/Wd-1）×100%。

1.3.3? 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

由于酪蛋白糖巨肽不易被考馬斯亮藍(lán)染色，因此，考馬斯亮藍(lán)染色法并不能適用于研究蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定，可采用雙縮脲蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定法對其進(jìn)行檢測，具體方法見試劑盒使用方法說明書。

1.3.4? 唾液酸質(zhì)量濃度檢測

唾液酸是酪蛋白糖巨肽的指示標(biāo)志物，本研究采用唾液酸試劑盒法-間苯二酚-鹽酸法測試，具體方法參見試劑盒使用方法說明書。

1.3.5? 殼聚糖微球吸附分離CGMP的動態(tài)吸附過程穿透曲線的繪制

準(zhǔn)確量取50 mg/mL乳清粉母液100 mL，再用0.02 mol/L的乙酸鈉緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度25 mg/mL，調(diào)節(jié)pH至4.6后作為樣品。再量取60 mL殼聚糖微球裝柱，用pH為4.6的緩沖液平衡后加樣200 mL，利用部分收集器收集吸附流出液，對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和唾液酸質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測，并繪制出動態(tài)穿透曲線。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? 交聯(lián)殼聚糖微球的性質(zhì)測定

2.1.1? 交聯(lián)殼聚糖微球的形態(tài)觀察和粒徑測定結(jié)果

通過反向乳液交聯(lián)的方法制備交聯(lián)殼聚糖微球，經(jīng)觀察，所制備的殼聚糖微球呈黃色細(xì)粉狀，具有較好的分散性，表面比較光滑。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)微球大部分呈較好的球形，所制備的交聯(lián)殼聚糖微球粒徑分別為：121.05、73.68、100.00、63.16、100.00、110.53、100.00、105.26、73.68、78.95、100.00、115.79、94.74、105.26、89.47、110.53、89.47、78.95、68.42、121.05 μm，經(jīng)計算平均粒徑為95.32 μm。

2.1.2? 交聯(lián)殼聚糖微球溶脹率及含水量的測定結(jié)果

用去離子水將微球充分溶脹，再用濾紙吸干表面的水分，測定濕重Ww=5.27 g，接著在60℃下烘干至恒重，然后測干重Wd=2.68 g，計算樹脂的溶脹率及含水量分別為196.64%和49.15%。

2.2? 殼聚糖微球吸附分離CGMP的動態(tài)吸附過程穿透曲線的繪制

按照1.3.3中的實(shí)驗(yàn)方法，測定部分收集器收集的收集液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和唾液酸質(zhì)量濃度，并繪制出動態(tài)吸附過程穿透曲線，結(jié)果如圖1所示。

從圖1的穿透曲線可以看出，吸附流出液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和唾液酸質(zhì)量濃度的變化趨勢基本相同。并且在收集液體積達(dá)到24 mL左右時，流出液中開始檢出蛋白質(zhì)和唾液酸，說明此時樣品中的蛋白質(zhì)和唾液酸開始發(fā)生穿透，當(dāng)收集液體積達(dá)到64 mL左右時，流出液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和唾液酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，蛋白質(zhì)和唾液酸基本全部穿透，說明此時殼聚糖微球?qū)GMP的吸附已達(dá)飽和。

3? ? 結(jié)語

本研究首先用反向乳液交聯(lián)法制備了交聯(lián)殼聚糖微球，對交聯(lián)殼聚糖微球的特性進(jìn)行了觀察和測定。結(jié)果表明，所制備的交聯(lián)殼聚糖微球大多數(shù)呈黃色球形，經(jīng)測定交聯(lián)殼聚糖微球的平均粒徑為95.32 μm;同時測定它的溶脹率和含水量，得到所制備的交聯(lián)殼聚糖微球的溶脹率為196.64%，含水量為49.15%。然后研究了殼聚糖微球吸附分離CGMP的動態(tài)吸附過程穿透曲線，從曲線可以看出，吸附流出液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和唾液酸質(zhì)量濃度的變化趨勢基本相同，并且，收集液體積達(dá)到24 mL時，樣品中的蛋白質(zhì)和唾液酸開始發(fā)生穿透，收集液體積達(dá)到64 mL時，蛋白質(zhì)和唾液酸基本全部穿透。

通過最后的分析研究，發(fā)現(xiàn)本課題的實(shí)驗(yàn)方法還有很多需要改進(jìn)的地方。首先，制得的交聯(lián)殼聚糖微球的機(jī)械強(qiáng)度不高，容易碎裂且性質(zhì)不夠穩(wěn)定，所以要進(jìn)一步研究交聯(lián)殼聚糖微球的制備方法，努力得到機(jī)械強(qiáng)度和性質(zhì)穩(wěn)定的殼聚糖微球。其次，未能研究樣品液的pH、加樣的質(zhì)量濃度、氯化鈉洗脫液的質(zhì)量濃度梯度和洗脫速度等對殼聚糖微球吸附分離CGMP的影響。

[參考文獻(xiàn)]

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