骨髓間充質(zhì)干細胞及其對脊髓損傷的治療

曹 娟，李秀云，李春蘭，隋曉娜，唐 靜

1 脊髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）的特性

1.1 BMSC起源及體外分離、培養(yǎng)和鑒定

1.1.1 BMSC起源 BMSC是一種最早從骨髓中分離的成體干細胞，因其能夠誘導(dǎo)分化為中胚層來源的間質(zhì)細胞而得名。BMSC屬成人干細胞，又稱成纖維細胞集落形成單位 （fibroblastic colony forming unit，F(xiàn)CFU）或間質(zhì)祖細胞（mesenchymal progenitor cells，MPC），因主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)，骨髓為主要來源，統(tǒng)稱為BMSC。Minguell等將BMSC概括為：存在于脊髓間充質(zhì)內(nèi)的非造血來源的細胞亞群，可在體外擴增，并可誘導(dǎo)分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、肌管、神經(jīng)細胞與支持造血的干細胞的基質(zhì)。

1.1.2 分離 目前BMSC的體外分離主要用細胞表面分子標(biāo)記分選法、細胞貼壁篩選法、密度梯度離心法、細胞篩篩選法等。細胞表面分子標(biāo)記分選法分離細胞的純度與所選擇的表面活性分子密切相關(guān)，但目前仍未發(fā)現(xiàn)特異性的BMSC表面標(biāo)記，單克隆抗體磁珠分離系統(tǒng)和流式細胞術(shù)也可用于細胞分離，但降低細胞活性。細胞貼壁篩選所分離的BMSC純度較低，而且傳代培養(yǎng)也難以去除雜質(zhì)。目前應(yīng)用較為廣泛的是細胞貼壁篩選法加密度梯度離心法。

1.1.3 培養(yǎng) BMSC具有自我更新和多向分化潛能，傳代培養(yǎng)，細胞形態(tài)均一，生長方式為貼附型，形態(tài)類似于成纖維細胞，呈梭形、紡錘形，克隆樣生長，培養(yǎng)至9代后生長減慢，胞質(zhì)空泡化、胞體變大等老化現(xiàn)象[1]。目前使用最為廣泛的BMSC培養(yǎng)基含10%胎牛血清的低糖DMEM，10%胎牛血清和1%雙抗，以95%飽和濕度，37℃ CO2孵箱培育。擴增BMSC時常用標(biāo)記方法包括熒光標(biāo)記法；化學(xué)標(biāo)記法；Y染色體標(biāo)記法等方法?；瘜W(xué)及熒光標(biāo)記技術(shù)簡單、專一性強、標(biāo)記效率高，但適用于短期標(biāo)記移植細胞；而且熒光標(biāo)記只能判定細胞的存在，無法觀察細胞形態(tài)。再者，標(biāo)記細胞凋亡或死亡后會釋放標(biāo)記物，一方面可標(biāo)記周圍細胞，造成假陽性，一方面如果被巨噬細胞吞噬，細胞碎片也可以有熒光表達。對標(biāo)記細胞在同一動物、不同時間活體內(nèi)的追蹤常用放射性核素標(biāo)記法、超順磁性三氧化二鐵納米微粒（SPIO）標(biāo)記法、生物發(fā)光活體成像技術(shù)。MRI活體示蹤磁性標(biāo)記細胞，可對BMSC遷移、增殖、分化進行監(jiān)測，但不同部位的移植細胞需采用不同顯影劑，應(yīng)用受限。此外還有細胞膜標(biāo)記、Hoechst標(biāo)記等方法。

1.1.4 鑒定 在表型上，至今仍未發(fā)現(xiàn)BMSC有特異性的表面標(biāo)記物。目前主要通過兩種方法鑒定：形態(tài)學(xué)特征及生長特點成纖維細胞樣生長，如前所述；再者即排除法：BMSC在體外實驗中主要根據(jù)其分化為間充質(zhì)干細胞系如脂肪細胞、成軟骨細胞等[2]；以及表達特定的細胞表面標(biāo)志物鑒定：BMSC表達多種表面標(biāo)志物，包括細胞外基質(zhì)成分、細胞因子、生長因子及其受體等，但造血及內(nèi)皮細胞表達的抗原陰性。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與造血、內(nèi)皮細胞一致的標(biāo)志物（尤其是CD45、CD34等），BMSC 表達陰性，而與基質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞一致的標(biāo)志物如CD44、CD29、CD13等表達陽性。 雖然國際細胞治療協(xié)會 標(biāo) 準(zhǔn) ，BMSC 應(yīng) 表 達 CD106、CD90、CD73； 不 表 達CD45，CD19，CD19或 CD79，CD14或 CD11b，也不表達成纖維細胞的組織相容性抗原－DR 型（HLA－DR）等[3]，但目前其具體表型標(biāo)志還不明確，這一標(biāo)準(zhǔn)也不是唯一參數(shù)。

1.2 BMSC的生物學(xué)特性

1.2.1 形態(tài)和生長方式 BMSC在形態(tài)上呈現(xiàn)為成纖維樣或不規(guī)則樣，胞質(zhì)豐富，核染色質(zhì)細，核仁明顯，平行排列或旋渦樣生長。

1.2.2 自我更新 BMSC具有較強的端粒酶活性，可通過不對稱分裂方式增殖，實現(xiàn)分化、增殖，維持自身干細胞的數(shù)量。

1.2.3 多向分化潛能 已有研究表明，BMSC可以向中胚層、外胚層、內(nèi)胚層分化。

1.3 BMSC的免疫學(xué)特性及免疫修復(fù)機制

1.3.1 BMSC的免疫抑制性 BMSC具有弱免疫原性，僅表達中等水平的主要組織相容性抗原Ⅰ（HLA－Ⅰ）類分子，不表達 HLA－Ⅱ類分子、Fas配體和 B7－1、B7－2、CD40、CD40L等協(xié)同刺激分子，能夠逃避移植受者免疫系統(tǒng)的識別。BMSC可通過分泌可溶性因子或外界激活／刺激而對移植受者產(chǎn)生負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，當(dāng)BMSC與同種異體組織接觸并釋放可溶因子免疫抑制最有效。BMSC可誘導(dǎo)T淋巴細胞失能，表現(xiàn)為不能增殖以及在抗原刺激后通常是在沒有足夠刺激后，不分泌細胞因子，抑制樹突狀細胞（DC）的發(fā)育及功能，向成骨細胞分化后的BMSC仍具有免疫調(diào)節(jié)功能[4]。BMSC還誘導(dǎo)Th1減少INF－γ分泌，誘導(dǎo)Th2分泌IL－4。在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎中，給予同種異體BMSC可能通過降低T細胞增殖反應(yīng)、降低血清IL－4、INF－γ水平等途徑阻止軟骨和骨的不可逆性免疫破壞[5]。對于B細胞，BMSC可通過抑制B細胞與NK細胞的增殖和活化而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[6]。BMSC可通過產(chǎn)生介質(zhì)抑制B細胞的增殖和分化，使B淋巴細胞停留在G0／G1期，從而產(chǎn)生抑制作用；或下調(diào)B細胞趨化因子受體等途徑減弱B細胞向炎癥部位募集[7]。在混合淋巴細胞培養(yǎng)中，BMSC能夠抑制T細胞和B細胞增殖。BMSC對DC的抑制作用表現(xiàn)為，共同培養(yǎng)BMSC與DC時，發(fā)現(xiàn)DC衍生物CD14＋單核細胞反應(yīng)減弱，成熟DC標(biāo)志CD83的表達減少，抑制單核細胞系向抗原提呈細胞分化，或通過阻斷細胞周期而抑制樹突狀細胞的分化和功能[8]。

1.3.2 BMSC的免疫刺激作用 在血液、脾臟的淋巴細胞中，BMSC有輕度增加IgG和INF－γ分泌的作用。新近研究表明，人和小鼠的BMSC在體外用γ干擾素和異種可溶性蛋白質(zhì)處理后，能充當(dāng)抗原提呈細胞，并通過HLA－Ⅱ類分子途徑產(chǎn)生保護性的免疫反應(yīng)。

2 BMSC治療與SCI后脊髓修復(fù)

2.1 脊髓損傷后功能恢復(fù)的機制 軸突損傷后，即使神經(jīng)元胞體仍然存活，神經(jīng)元功能也可能缺失。用BMSC對損傷脊髓干預(yù)，旨在通過改變SCI后的病理過程從而促進脊髓功能恢復(fù)，可能修復(fù)機制主要包括：①分化成受損神經(jīng)組織細胞，達到結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)[9]：但目前仍然備受爭議，部分學(xué)者不贊同 BMSC 神經(jīng)分化觀點[10，11]；②分泌生長因子和細胞因子，為軸突或神經(jīng)元再生提供最佳微環(huán)境：損傷脊髓內(nèi)的神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等營養(yǎng)因子的含量明顯增高，神經(jīng)元軸突再生明顯；神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、軸突生長、突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生，但這些因子受到神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕抑制，因此它們改變脊髓損傷的微環(huán)境作用是有限的[12－15]；③移植材料填充損傷部位并形成細胞橋，從而為損傷軸突的再生提供機械或生物通道[16]；④減輕急慢性炎癥反應(yīng)，免疫抑制，保護組織，加強感覺運動功能的恢復(fù)：減輕脊髓損傷急性炎癥反應(yīng)，防止再損傷的發(fā)生和星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞的反應(yīng)[17，18]。

2.2 BMSC移植治療SCI的動物 BMSC移植治療SCI的動物實驗，將BMSC體外誘導(dǎo)分化為Schwann細胞移植入損傷7d后的小鼠脊髓，損傷脊髓囊腔變小，軸突再生，小鼠后肢功能恢復(fù)顯著。Bakshi等發(fā)現(xiàn)，選用表達人胎盤堿性磷酸酶的轉(zhuǎn)基因大鼠，將獲取的BMSC經(jīng)腰穿移植入SD大鼠的SCI部位，能夠減少SCI囊變和再損傷的發(fā)生，而將人BMSC用于治療脊髓半橫斷損傷的大鼠，無須進行免疫抑制，大鼠可存活數(shù)月，并且沒有出現(xiàn)炎癥或免疫排斥反應(yīng)[19]。將BMSC經(jīng)靜脈注射用于成體動物，BMSC可遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，表達神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，如神經(jīng)核蛋白（NeuN）、βⅢ微管蛋白（Tubulin2βⅢ）等，因而被認(rèn)為已經(jīng)分化為成熟的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，有望形成新的神經(jīng)環(huán)路。通過大量的嚙齒類和靈長類動物實驗證實BMSC對脊髓損傷部分功能恢復(fù)是有效的，并且是安全的，這為BMSC的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.3 BMSC 臨床應(yīng)用

2.3.1 完全性、不完全性脊髓損傷 移植治療不完全性脊髓損傷患者，肌肉力量，關(guān)節(jié)僵硬，感覺，尿便自控力，少數(shù)患者性功能等方面會有較為明顯的改善。完全性損傷則治療效果很有限：感覺障礙范圍縮小，肌張力降低和輕度肌力提高[20]。

2.3.2 脊髓損傷的急性期、亞急性期和慢性期 急性期或亞急性期BMSC臨床治療較以往傳統(tǒng)治療都取得了較理想的功能恢復(fù)。對于慢性期患者，大部分研究證實BMSC治療效果不明顯。即便有少數(shù)患者在注射BMSC后立即出現(xiàn)感覺或功能好轉(zhuǎn)，但這些改善也往往會在之后的3～4個月消失[21]。暫時的感覺和功能的改善主要是因為BMSC注射時，硬脊膜被輕微的損傷刺激、腦脊液暫時恢復(fù)、休眠的神經(jīng)元被刺激、神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的斷裂引起的，而不是因為BMSC的植入。因為BMSC植入后細胞擴增及各種因子的分泌都有一定的潛伏期。國內(nèi)研究證實完全性脊髓損傷接受移植治療的時間超過傷后3年，則治療效果很有限，最常見的改善是感覺障礙范圍縮小、肌張力降低和輕度肌力提高[20]。

目前BMSC治療SCI的具體機制尚不十分清楚，雖然多數(shù)的動物實驗和臨床研究證實BMSC移植治療后，SCI導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺失癥狀能明顯得以改善，但臨床試驗中獲得顯著功能改善的結(jié)論很少。RakhiPal等[22]通過長期隨訪證實經(jīng)BMSC治療的SCI患者沒有明顯的不良反應(yīng)及帶來額外的并發(fā)癥，而且都有不同程度的功能恢復(fù)，證實骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療脊髓損傷是安全的，但這一結(jié)果還需要大量臨床報告證實。因治療而導(dǎo)致的神經(jīng)性疼痛或腫瘤等并發(fā)癥正處于進一步研究階段。目前干細胞聯(lián)合治療方案已經(jīng)成為SCI治療的一種新趨勢。

2.3.3 BMSC治療的方式及時機的選擇 靜脈注射法是一種更為便捷的方法，但是細胞注射到血液中，只有很少一部分能植入脊髓內(nèi)，到達損傷局部的更是微乎其微；局部注射法注射的BMSC能最大限度地移植入脊髓損傷部位，進而發(fā)揮促進修復(fù)的作用；腰穿注射BMSC能夠通過腦脊液循環(huán)到達脊髓損傷局部，并且可以進入脊髓內(nèi)部，是目前最好的移植方法；定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元或者神經(jīng)膠質(zhì)細胞后再進行細胞移植，或許是一種更為有效的治療方法；還可聯(lián)合其他細胞、細胞因子、組織工程支架、藥物移植。

脊髓損傷后，幾分鐘內(nèi)局部即可發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。傷后1h，前角細胞出現(xiàn)中央染色溶解和缺血。傷后4h，出血呈離心性，傷后21h有明顯脫髓鞘改變，出現(xiàn)多形核白細胞浸潤等改變繼而并發(fā)繼發(fā)性損傷，這一急性過程約持續(xù)7d左右。細胞移植過早，因急性期血腦屏障破壞嚴(yán)重的炎癥免疫反應(yīng)會導(dǎo)致移植的干細胞壞死；過晚由于脊髓損傷部位膠質(zhì)瘢痕形成，神經(jīng)纖維難以再生。因此許多學(xué)者則認(rèn)為10～14d亞急性階段為BMSC最佳的治療時間[21]。但有研究證實鼠脊髓損傷后6h至28d不同時間點經(jīng)BMSC治療，行為測試結(jié)果證實6h及1、3d早期治療結(jié)果好于后期[23]。但也有觀點認(rèn)為SCI的急性期、亞急性期及慢性期都可適用于BMSC治療：BMSC可調(diào)節(jié)急性期劇烈的炎癥反應(yīng)，在亞急性及慢性期降低神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕抑制，為軸突再生提供持續(xù)的最佳微環(huán)境[15]。目前干細胞治療脊髓損傷的機制探討不是很明確，因此治療的最佳時機仍需通過大樣本、長期臨床觀察方能確定。

3 問題及展望

BMSC移植治療SCI在臨床仍處于起步階段，有很多問題亟待闡明：①BMSC的自身基因調(diào)控機制；②BMSC與宿主神經(jīng)組織相互融合的機制；③BMSC分化而來的神經(jīng)細胞是否具有完整的神經(jīng)元功能，移植后的神經(jīng)細胞之間能否建立精確的聯(lián)系；④盡管大量動物實驗及臨床試驗已經(jīng)證明BMSC移植治療SCI可顯著促進神經(jīng)功能恢復(fù)，但應(yīng)如何進一步明確及提高療效；⑤BMSC移植治療的臨床應(yīng)用亟須大樣本的隨機對照研究以確認(rèn)遠期效果及安全性（腫瘤化與分化誘導(dǎo)）；⑥BMSC的臨床試驗設(shè)計，SCI患者選擇，SCI治療結(jié)果評價等需要根據(jù)臨床前的實驗進一步的優(yōu)化。

盡管如此，復(fù)習(xí)文獻可知BMSC具有強大的增殖能力和多向分化潛能，可向非間質(zhì)細胞譜系如神經(jīng)細胞分化的潛能，易于培養(yǎng)，移植后免疫性低，能夠通過改變SCI后的病理過程從而促進脊髓功能恢復(fù)且倫理問題爭議少，對SCI疾病的防治前景較為廣闊。

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