他克莫司對阿霉素腎病大鼠腎組織氧化應(yīng)激及klotho蛋白表達(dá)的影響

張靜　王雁飛　劉麗秋　宋起

[摘要] 目的 觀察他克莫司對阿霉素腎病大鼠腎組織氧化應(yīng)激及klotho蛋白表達(dá)的影響。方法 將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組（NC組）、阿霉素腎病模型組（ADR組）、奧美沙坦酯治療組（OLM組）、他克莫司治療組（FK506組），每組15只。其中ADR組、OLM組、FK506組均給予一次性尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg構(gòu)建阿霉素腎病模型。造模成功后，OLM組、FK506組分別連續(xù)12周給予奧美沙坦酯10 mg/（kg·d）、他克莫司0.5 mg/（kg·d）灌胃，NC組及ADR組分別給予等量生理鹽水灌胃。分別于實驗第4、8、12周末檢測各組大鼠24 h尿蛋白;每組分別于實驗第4、8、12周末各處死5只大鼠，取腎組織，測定其超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，蘇木精-伊紅染色觀察其形態(tài)學(xué)變化，實時熒光定量PCR（q-PCR）檢測klotho mRNA的表達(dá)，Wes-tern blot檢測klotho蛋白的表達(dá)。結(jié)果 ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點24 h尿蛋白含量均高于NC組，OLM組和FK506組較ADR組降低，F(xiàn)K506組較OLM組降低，差異均有顯著性（F=126.969～781.905，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中SOD活性均較NC組降低，OLM組和FK506組較ADR組升高，F(xiàn)K506組較OLM組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=125.782～467.589，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中MDA含量均較NC組升高，OLM組及FK506組較ADR組降低，F(xiàn)K506組較OLM組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=52.782～162.589，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中klotho的表達(dá)均較NC組降低，OLM組及FK506組較ADR組升高，F(xiàn)K506組較OLM組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=116.671～609.513，P<0.05）。結(jié)論 阿霉素腎病大鼠腎臟組織klotho表達(dá)降低，他克莫司相對于奧美沙坦酯可以明顯提高阿霉素腎病大鼠腎臟組織中klotho的表達(dá)，減少腎臟氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞] 他羅利姆;腎病綜合征;多柔比星;氧化性應(yīng)激;klotho蛋白;大鼠

[中圖分類號] R979.5;R692 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號] ?2096-5532（2019）04-0469-06

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of tacrolimus on oxidative stress and klotho protein expression in renal tissue in rats with adriamycin nephropathy. ?Methods A total of 60 male Wistar rats were randomly divided into normal control group （NC group）， adriamycin nephropathy group （ADR group）， olmesartan medoxomil treatment group （OLM group）， and tacrolimus treatment group （FK506 group）， with 15 rats in each group. The rats in the ADR group， the OLM group， and the FK506 group were given one-time injection of 5 mg/kg adriamycin via the caudal vein to establish a model of adriamycin nephropathy. After modeling， the rats in the OLM group and the FK506 group were given olmesartan medoxomil （10 mg·kg-1·d-1） and tacrolimus （0.5 mg/kg-1·d-1）， respectively， by gavage for 12 consecutive weeks， and those in the NC group and the ADR group were given an equal volume of normal saline by gavage. 24 h urinary protein was measured at the end of weeks 4， 8， and 12. Five rats in each group were sacrificed at the end of weeks 4， 8， and 12， and renal tissue was collected to measure superoxide dismutase （SOD） activity and malondialdehyde （MDA） content; hematoxylin and eosin staining was used to observe morphological changes， and quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of klotho. ?Results At all time points， the ADR group， the OLM group， and the FK506 group had significantly higher 24 h urinary protein than the NC group; the OLM group and the FK506 group had significantly lower 24 h urinary protein than the ADR group; the FK506 group had significantly lower 24 h urinary protein than the OLM group （F=126.969-781.905，P<0.05）. At all time points， the ADR group， the OLM group， and the FK506 group had significantly lo-wer SOD activity in renal tissue than the NC group; the OLM group and the FK506 group had significantly higher SOD activity than the?ADR group; the FK506 group had significantly higher SOD activity than the OLM group （F=125.782-467.589，P<0.05）. At all time points， the ADR group， the OLM group， and the FK506 group had significantly higher MDA content in renal tissue than the NC group; the OLM group and the FK506 group had significantly lower MDA content than the ADR group; the FK506 group had significantly lower MDA content than the OLM group （F=52.782-162.589，P<0.05）. At all time points， the ADR group， the OLM group， and the FK506 group had significantly lower expression of klotho in renal tissue than the NC group; the OLM group and the FK506 group had significantly higher expression than the ADR group; the FK506 group had significantly higher expression than the OLM group （F=116.671-609.513，P<0.05）. ?Conclusion There is a reduction in the expression of klotho in renal tissue in rats with adriamycin nephropathy. Compared with olmesartan medoxomil， tacrolimus can significantly increase the expression of klotho in renal tissue and reduce oxidative stress injury in the kidney in rats with adriamycin nephropathy.

[KEY WORDS] tacrolimus; nephrotic syndrome; doxorubicin; oxidative stress; klotho protein; rats

腎病綜合征是一種發(fā)展緩慢、相對良性的疾病，但若未能及時有效診治可導(dǎo)致病情進(jìn)展甚至發(fā)展成為慢性腎衰竭。氧化應(yīng)激是多種病理損傷的共同途徑，貫穿于慢性腎臟病發(fā)生、發(fā)展的過程中。慢性腎臟病的發(fā)生、發(fā)展及惡化與體內(nèi)氧化物質(zhì)增多、抗氧化物質(zhì)減少密切相關(guān)[1]。KURO-O等[2]研究顯示，klotho主要在腎臟中高表達(dá)。MITANI等[3]采用原位雜交技術(shù)研究表明，Klotho mRNA主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，氧化應(yīng)激和腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的激活可以抑制其在腎臟中的表達(dá)。有研究結(jié)果表明，在腎小球腎炎模型小鼠體內(nèi)過表達(dá)klotho蛋白，可使小鼠具有對抗氧化應(yīng)激從而減少腎損傷的功能[4]。以上研究表明，klotho蛋白在體內(nèi)能夠抑制氧化應(yīng)激，可以通過檢測klotho蛋白在體內(nèi)的表達(dá)水平估測小鼠腎臟的損傷情況。奧美沙坦酯為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，臨床上常用于降低血壓和減少尿蛋白。有研究表明，奧美沙坦酯通過抑制血管緊張素Ⅱ引起的氧化應(yīng)激起到保護(hù)腎臟的作用[5]。他克莫司為新型免疫抑制劑，屬于鈣調(diào)神經(jīng)蛋白酶抑制劑，可對鈣離子傳導(dǎo)通路進(jìn)行干擾，特異性提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，減弱細(xì)胞去磷酸化功能，對白細(xì)胞介素分泌進(jìn)行控制，發(fā)揮免疫抑制作用，近年來開始應(yīng)用于腎病綜合征的臨床治療，具有減少尿蛋白、延緩腎臟疾病進(jìn)展的作用。本研究采用單次尾靜脈注射阿霉素方法建立阿霉素腎病模型，給予奧美沙坦酯及他克莫司灌胃治療，探討兩種藥物對模型大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)及klotho蛋白表達(dá)的影響，以期為他克莫司治療腎病綜合征提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量230～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房。

1.1.2 主要試劑 奧美沙坦酯（第一三共制藥（上海）有限公司），鹽酸阿霉素（MedChemExpress），他克莫司（Astellas Ireland Co.，Ltd），兔抗鼠anti-klotho多克隆抗體（英國Abcam），β-actin（北京博奧森），免疫組化試劑盒（北京中杉金橋），DAB顯色試劑盒（福州邁新），蘇木精-伊紅染色試劑（北京索萊寶），Trizol試劑（美國Invitrogen），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒（北京Takara）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組（NC組）、阿霉素腎病模型組（ADR組）、奧美沙坦酯治療組（OLM組）以及他克莫司治療組（FK506組），每組15只。其中ADR組、OLM組和FK506組大鼠給予一次性尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg造模，NC組大鼠注射等量的生理鹽水。7 d后留取大鼠24 h尿蛋白，與正常對照大鼠相比，尿蛋白升高有統(tǒng)計學(xué)意義視為造模成功[6]。造模后，OLM組連續(xù)12周給予奧美沙坦酯10 mg/（kg·d）灌胃[5]，F(xiàn)K506組連續(xù)12周給予他克莫司0.5 mg/（kg·d）灌胃[7]，NC組及ADR組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 24 h尿蛋白檢測 于實驗第4、8、12周末從每組中隨機(jī)各選5只大鼠放入清潔代謝籠中，收集24 h尿液，-80 ℃保存，用于檢測24 h尿蛋白定量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 標(biāo)本采集 分別于實驗第4、8、12周末每組取5只大鼠，處死，打開腹腔游離腎臟。迅速取出一側(cè)腎臟放入40 g/L中性甲醛中固定，4 ℃保存，用于蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色;將另一側(cè)腎組織快速放入液氮中，-80 ℃保存，用于Wes-tern blot和實時熒光定量PCR（q-PCR）。

1.2.4 腎組織病理學(xué)觀察 腎組織經(jīng)包埋制成石蠟切片，切片脫蠟、復(fù)水后經(jīng)蘇木精染色10 min、伊紅染色5 min，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察腎組織病理改變。

1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的測定 采用羥胺法檢測大鼠腎組織中SOD活性，采用比色法檢測大鼠腎組織中MDA含量。均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.6 Western blot檢測klotho蛋白的表達(dá) 提取腎組織中總蛋白，加入RIPA裂解液勻漿后，用BCA法檢測蛋白濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液，金屬浴煮沸5 min，各組蛋白分別上樣，用100 g/L SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以體積分?jǐn)?shù)0.05的牛奶封閉1 h，加入一抗klotho（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗常溫孵育，洗膜后顯影，用Image J軟件分析蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.7 q-PCR檢測klotho mRNA的表達(dá) 按照Triol試劑說明書提取腎組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行q-PCR。引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃、10 s，57 ℃、30 s，共40個循環(huán)。用2-△△Ct計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所得實驗數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用析因設(shè)計的方差分析，相關(guān)性分析采用Spearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 造模后大鼠一般情況

大鼠尾靜脈注射阿霉素1周后均出現(xiàn)不同程度的腹瀉，食量下降，活動減少;2周后腹瀉逐漸停止，飲食及活動逐漸恢復(fù);第3周出現(xiàn)輕度水腫，以足部及睪丸最明顯;第4周水腫最重。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量比較

大鼠24 h尿蛋白定量檢測組別與時間存在交互效應(yīng)（F時間×組別=101.579，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點24 h尿蛋白含量均高于NC組，OLM組和FK506組較ADR組降低，F(xiàn)K506組較OLM組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=126.969～781.905，P<0.05）;組內(nèi)比較，隨著時間的延長，ADR組24 h時尿蛋白含量進(jìn)行性升高，OLM組和FK506組進(jìn)行性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.957～182.942，P<0.05）。見表2。

2.3 大鼠腎組織病理學(xué)觀察

與NC組相比，ADR組實驗第4周末可見腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮，上皮細(xì)胞內(nèi)有顆粒和空泡變性，近端小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、管腔擴(kuò)大并可見蛋白管型及少量炎細(xì)胞浸潤;第8周末可見腎小管上皮細(xì)胞明顯萎縮，空泡及顆粒變性更加明顯，管內(nèi)蛋白管型較前增多，間質(zhì)血管腫脹更加明顯，炎細(xì)胞數(shù)量增多;第12周末可見腎小管灶狀萎縮，蛋白管型更多，腎間質(zhì)小動脈管壁增厚、管腔狹窄，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤更加明顯，并有輕度纖維化。OLM組和FK506組大鼠腎臟的病理表現(xiàn)較ADR組呈時間依賴性的減輕，且FK506組病理改變較OLM組更加明顯。

2.4 各組大鼠腎組織SOD活性和MDA含量比較

大鼠腎組織SOD活性檢測組別與時間存在交互效應(yīng)（F時間×組別= 201.531，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中SOD活性均較NC組降低，OLM組和FK506組較ADR組升高，F(xiàn)K506組較OLM組升高，差異均有顯著意義（F=125.782～467.589，P<0.05）;組內(nèi)比較，隨著時間的延長，ADR組大鼠腎組織中SOD活性進(jìn)行性降低，OLM組及FK506組進(jìn)行性升高，差異具有顯著性（F=6.871～57.072，P<0.05）。見表3。

大鼠腎組織MDA含量檢測組別與時間存在交互效應(yīng)（F時間×組別= 67.026，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中MDA含量均較NC組升高，OLM組及FK506組較ADR組降低，F(xiàn)K506組較OLM組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=52.782～162.589，P<0.05）;組內(nèi)比較，隨著時間的延長，ADR組大鼠腎組織中MDA含量進(jìn)行性升高，OLM組及FK506組進(jìn)行性降低，差異具有顯著性（F=6.871～57.072，P<0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠腎組織中klotho mRNA表達(dá)的比較

大鼠腎組織中klotho mRNA表達(dá)檢測組別與時間存在交互效應(yīng)（F時間×組別=326.571，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中klotho mRNA的表達(dá)均較NC組降低，OLM組及FK506組較ADR組升高，F(xiàn)K506組較OLM組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=116.671～507.513，P<0.05）;組內(nèi)比較，隨著時間的延長，ADR組大鼠腎組織中klotho mRNA的表達(dá)進(jìn)行性降低，OLM組和FK506組的表達(dá)進(jìn)行性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.982～40.485，P<0.05）。見表5。

2.6 各組大鼠腎組織中klotho蛋白表達(dá)的比較

大鼠腎組織中klotho蛋白表達(dá)檢測組別與時間存在交互效應(yīng)（F時間×組別=223.581，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中klotho蛋白的表達(dá)均較NC組降低，OLM組及FK506組較ADR組升高，F(xiàn)K506組較OLM組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=126.969～609.513，P<0.05）;組內(nèi)比較，隨著時間的延長，ADR組大鼠腎組織中klotho蛋白表達(dá)進(jìn)行性降低，OLM組和FK506組進(jìn)行性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.985～38.405，P<0.05）。見圖1。

2.7 klotho表達(dá)與氧化應(yīng)激的關(guān)系

大鼠腎組織中klotho蛋白表達(dá)與MDA含量及24 h尿蛋白定量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.896、-0.948，P<0.01），與SOD活性呈正相關(guān)（r=0.927，P<0.01）。見圖2。

3 討 ?論

阿霉素腎病模型是目前公認(rèn)的腎病綜合征動物模型。阿霉素對腎臟具有慢性毒性作用，它可以通過多種機(jī)制引起腎臟損傷，其中氧化應(yīng)激是比較常見和重要的機(jī)制之一。有研究表明，活性氧（ROS）是引起足細(xì)胞損傷的重要因素[8]。另有研究表明，ROS可引起腎小管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，影響腎小管的重吸收作用，從而導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)隨尿液排出體外，引起蛋白尿[9]。蛋白尿是診斷腎病綜合征的標(biāo)準(zhǔn)之一，也是腎功能進(jìn)展的獨立危險因素。Klotho是一種與衰老相關(guān)的基因，其對機(jī)體的保護(hù)作用已經(jīng)被廣泛報道[10]。LIM等[11]研究表明，klotho通過抑制氧化應(yīng)激、RAS激活和改善線粒體功能發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。另有研究表明，klotho過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的錳超氧化物歧化酶（MnSOD）表達(dá)量升高[12-13]，從而起到抑制氧化應(yīng)激的作用。然而有研究表明，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激時，klotho基因在腎臟的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)均減少[4]。ROS的產(chǎn)生是阿霉素腎病模型大鼠腎臟損傷的主要原因，因此，抑制氧化應(yīng)激不僅可減輕其對腎臟的損傷還可提高klotho基因在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)，從而起到保護(hù)腎臟的作用。

研究表明，腎臟RAS過度激活與許多腎臟疾病有關(guān)，RAS過度激活的主要效應(yīng)包括氧化應(yīng)激、NF-κB激活、纖維母細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積等[14]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）類藥物具有降血壓、減少尿蛋白及保護(hù)腎臟的作用，其減少尿?蛋白的主要機(jī)制為阻斷RAS，減少血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的產(chǎn)生。本研究以Wistar大鼠作為研究對象，采用一次性尾靜脈注射阿霉素方法建立阿霉素腎病模型，模型大鼠分別給予奧美沙坦酯和他克莫司治療12周，結(jié)果顯示，奧美沙坦酯組和他克莫司組24h尿蛋白定量均較ADR組明顯降低，證明奧美沙坦酯及他克莫司均具有減少尿蛋白的作用，這與既往的研究結(jié)論一致[15-16]。且他克莫司減少尿蛋白的療效優(yōu)于奧美沙坦酯。ACEI類藥物可減少AngⅡ的產(chǎn)生，也具有抗氧化的作用。局部AngⅡ與血管緊張素Ⅱ1型受體（AngⅡ1）結(jié)合后可激活NADH/NADPH氧化酶，使O2-、H2O2等ROS類物質(zhì)生成增多。AngⅡ還可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激其產(chǎn)生ROS增加，從而使血漿氧化應(yīng)激水平升高[17-18]。本研究結(jié)果顯示，在分別給予奧美沙坦酯和他克莫司治療4、8及12周后，奧美沙坦酯組及他克莫司組氧化應(yīng)激反應(yīng)均較模型組明顯減弱，且他克莫司減弱氧化應(yīng)激的作用較奧美沙坦酯更加明顯，表明他克莫司能有效減輕氧化應(yīng)激對腎臟的損害，其對腎臟的保護(hù)作用優(yōu)于奧美沙坦酯。有動物實驗結(jié)果表明，AngⅡ可下調(diào)klotho在腎臟中的表達(dá)[19]。糖尿病腎病大鼠給予纈沙坦治療后，其腎臟組織中klotho蛋白表達(dá)水平升高而氧化應(yīng)激反應(yīng)降低[15]。另有研究表明，在慢性腎衰竭病人體內(nèi)，klotho的表達(dá)量明顯下降，RAS和氧化應(yīng)激激活可抑制klotho在腎臟表達(dá)[20]。其機(jī)制可能是klotho通過抑制胰島素樣/胰島素樣生長因子-1介導(dǎo)的FoxO磷酸化而活化FoxO轉(zhuǎn)錄因子[21-22]，去磷酸化的FoxO能夠反過來上調(diào)抗氧化酶如過氧化氫酶-1和SOD的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，在實驗第4周末，ADR組大鼠腎組織中klotho的表達(dá)開始降低，第8、12周末降低更加明顯;分別給予奧美沙坦酯和他克莫司灌胃治療后，模型大鼠klotho的表達(dá)升高。實驗第4、8、12周末，OLM組和FK506組大鼠腎組織中klotho的表達(dá)均較ADR組顯著增加，且FK506組較OLM組增加更加明顯。

綜上所述，阿霉素腎病大鼠klotho表達(dá)下降與腎病綜合征的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān);在阿霉素腎病大鼠模型中，奧美沙坦酯和他克莫司均具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、提高腎組織中klotho表達(dá)進(jìn)而達(dá)到保護(hù)腎臟的作用，但他克莫司保護(hù)腎臟的作用優(yōu)于奧美沙坦酯。這兩種藥物的長期療效、安全性及腎臟保護(hù)作用的具體分子機(jī)制目前尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）