EB病毒相關(guān)伯基特淋巴瘤差異基因表達(dá)分析

鄭雨薇　肖華　王維文　劉雯

[摘要] 目的 從分子層面分析EB病毒（EBV）相關(guān)伯基特淋巴瘤（BL）的差異表達(dá)基因（DEGs），為其診療提供新的思路。方法 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）獲取EBV陽(yáng)性與陰性BL相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集GSE100458。通過(guò)morpheus篩選出DEGs，分別將上調(diào)和下調(diào)基因輸入Database for Annotation Visualizationand Integrated Discovery（DAVID）數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO分析;進(jìn)一步采用cytoscape篩選出10個(gè)TOP基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證其在EBV陽(yáng)性與陰性BL細(xì)胞系中表達(dá)情況。結(jié)果 分析EBV陽(yáng)性和EBV陰性的BL細(xì)胞系的前400個(gè)DEGs，包括200個(gè)上調(diào)基因和200個(gè)下調(diào)基因，上調(diào)基因主要集中在生長(zhǎng)因子活性通路、肝素結(jié)合通路、細(xì)胞外間隙通路;下調(diào)基因主要集中在伽馬微管蛋白結(jié)合通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜通路、逆行性小囊泡運(yùn)輸通路。對(duì)DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析后，篩選出核心基因乙酰輔酶A羧化酶β（ACACB）等10個(gè)基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在EBV陽(yáng)性與陰性BL組間，CDH1、PRPF19、UBE2N、F2、H6PD、VEGFA、YARS共7個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.878～32.601，P<0.05），ACACB、CTTN、IGF1共3個(gè)基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 EBV感染可導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變，生物信息學(xué)分析法可初步篩選出DEGs和相互作用的蛋白，為進(jìn)一步深入研究提供有價(jià)值的信息和思路。

[關(guān)鍵詞] 皰疹病毒4型;伯基特淋巴瘤;基因表達(dá);生物信息學(xué)

[中圖分類號(hào)] R373.9 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] ?2096-5532（2019）04-0423-06

[ABSTRACT] Objective To analyze the differentially expressed genes （DEGs） in EB virus （EBV）-associated Burkitt lymphoma （BL） at molecular level， and to provide new ideas for its diagnosis and treatment. ?Methods The EBV-positive and-negative BL-related gene microarray data set GSE100458 was obtained from the National Center for Biotechnology Information （NCBI）. DEGs were screened out by Morpheus， and the up-regulated and down-regulated genes were entered into the Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery （DAVID） for GO analysis. Ten top genes were identified by cytoscape， and their expression in EBV-positive and EBV-negative BL cell lines was verified by real-time fluorescence quantification PCR. ?Results The top 400 DEGs of EBV-positive and EBV-negative BL cell lines were analyzed， including 200 up-regulated genes and 200 down-regulated genes. The up-regulated genes were mainly concentrated in the growth factor activity pathway， heparin binding pathway， and extracellular gap pathway. The down-regulated genes were mainly concentrated in the gamma-tubulin binding pathway， endoplasmic reticulum pathway， and retrograde small vesicle transport pathway. After protein interaction analysis of DEGs，10 core genes such as acetyl coenzyme A carboxylase beta （ACACB） were screened out. Quantitative real-time PCR results showed that there were significant differences in transcriptional expression of 7 genes （CDH1， PRPF19， UBE2N， F2， H6PD， VEGFA， and YARS） between EBV-positive and EBV-negative BL groups （t=3.878-32.601，P<0.05）， and there were no significant diffe-rences in the expression of ACACB， CTTN， and IGF1 （P>0.05）. Conclusion EBV infection can lead to changes in the gene expression profiles of host cells. Bioinformatics analysis can preliminarily screen out DEGs and interacting proteins， providing valuable information and ideas for further research.

[KEY WORDS] herpesvirus 4， human; Burkitt lymphoma; gene expression; computational biology

EB病毒（EBV）是重要的DNA腫瘤病毒，與伯基特淋巴瘤（BL）、霍奇金病、某些T細(xì)胞源和B細(xì)胞源性非霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌以及胃癌等多種人類淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)[1]。地方性BL感染的EBV有兩種不同類型的毒株，即1型和2型EBV，兩種類型毒株特異性有所不同[2]。1型EBV毒株廣泛分布在世界各地，盡管淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系中1型EBV轉(zhuǎn)化率比2型高，?但2型EBV在非洲地區(qū)更為常見;兩種類型EBV均在非洲地方性BL中被發(fā)現(xiàn)，并且流行于撒哈拉以南的非洲健康人群中。然而，尚無(wú)研究對(duì)比初發(fā)地方性BL中1型和2型EBV的突變情況，病毒變異是否影響腫瘤的發(fā)生尚不清楚[3]?；虮磉_(dá)匯編（GEO）是基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源庫(kù)，其中匯聚大量的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，是多種生物信息學(xué)分析均需要使用的重要資源[4-5]。本文通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)得到有意義的基因，進(jìn)而驗(yàn)證EBV影響的BL的發(fā)生機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE100458基因表達(dá)譜，包括4種細(xì)胞系的14個(gè)克隆，其中Mutu、Akata和Awia細(xì)胞系分別包含2個(gè)EBV陽(yáng)性和2個(gè)EBV陰性克隆;Elijah細(xì)胞系包含1個(gè)EBV陽(yáng)性和1個(gè)EBV陰性克隆。GSE100458基于GPL23270 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)分析得來(lái)。

1.2 差異表達(dá)基因（DEGs）鑒定

采用R語(yǔ)言和Limma包篩選出DEGs，符合P值<0.01和|logFC|≥2標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)morpheus進(jìn)行基因表達(dá)聚類分析，根據(jù)噪聲比大小篩選出DEGs[6]。

1.3 DEGs的GO分析

獲得DEGs后，將DEGs列表提交到線上軟件Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov）v6.8，分別進(jìn)行上調(diào)基因和下調(diào)基因的GO分析[7]。GO（http：//www.geneontology.org）是分析DEGs和基因產(chǎn)物功能的工具，包括生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分[8]。最終，通過(guò)GO分析選擇被強(qiáng)化的DEGs的功能，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

采用Search Tool for theTetrieval of Interacting Genes（STRING）數(shù)據(jù)庫(kù)分析DEGs之間的相互作用關(guān)系，以解釋更深刻的分子機(jī)制。首先將DEGs列表提交到STRING上，采用組合分?jǐn)?shù)>0.4選取實(shí)驗(yàn)證實(shí)的相互作用，然后用cytoscape軟件分析構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。根據(jù)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用度篩選出頂級(jí)中樞基因。

1.5 DEGs表達(dá)

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將EBV陽(yáng)性淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Daudi，EBV陰性淋巴瘤細(xì)胞系Ramos，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2、99%濕度培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)棄培養(yǎng)液，收集2個(gè)不同批次細(xì)胞用于RNA提取。

1.5.2 RNA提取 用TRIzol法提取3種細(xì)胞系RNA，RNA濃度在200～1 000 μg/L、純度A260/A280在2.0左右為可使用范圍[9]。

1.5.3 cDNA合成 采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒滅活基因組DNA，反應(yīng)體系為10 μL，內(nèi)含：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 1 μg，剩余用RNase Free dH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件42 ℃、2 min。向上述反應(yīng)體系中加入：PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×Prime Script Buffer 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL;反應(yīng)條件為：37 ℃孵育15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增引物在Pubmed上進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μL，包括：SYBR GreenⅠreal-time PCR Master Mix 10 μL，上下游引物分別0.5 μmol/L，cDNA模板2 μL，無(wú)RNase水6 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性15 min;94 ℃、15 s，60 ℃、 30 s，70 ℃、30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熒光檢測(cè)。同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參照基因GAPDH以檢測(cè)RNA的完整性和反轉(zhuǎn)錄效果。擴(kuò)增結(jié)束后，95 ℃、1 min，55 ℃、30 s后逐步升溫至95 ℃進(jìn)行溶解曲線分析，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism（version 6.01）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以±s形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 聚類分析熱圖

從GEO數(shù)據(jù)集中篩出的GSE100458由7個(gè)EBV陽(yáng)性BL細(xì)胞系和7個(gè)EBV陰性BL細(xì)胞系組成，根據(jù)Morpheus軟件，以噪聲比絕對(duì)值≥0.5的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出200個(gè)上調(diào)基因和200個(gè)下調(diào)基因。DEGs聚類表達(dá)譜見圖1A。

2.2 GO分析

利用DAVID在線軟件對(duì)400個(gè)DEGs分類分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要參與調(diào)控生長(zhǎng)因子活性通路（GO：0008083）[10]、調(diào)控肝素結(jié)合通路（GO：0008201）、細(xì)胞外間隙通路（GO：0005615）、片狀偽

2.3 PPI分析

在蛋白質(zhì)間相互作用圖中，顏色越亮、面積越大，說(shuō)明與其他蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)度越大[11]（圖1D）。從中篩選10個(gè)關(guān)聯(lián)度最大的蛋白，其全稱、縮寫、關(guān)聯(lián)度見表2。

2.4 基因表達(dá)驗(yàn)證

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，EBV陽(yáng)性與陰性BL細(xì)胞系中ACACB、CTTN、IGF1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.103～1.294，P>0.05），與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)不相符;CDH1、PRPF19、UBE2N表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.878～9.730，P<0.05），網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相符合;F2、H6PD、VEGFA、YARS表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=7.055～32.601，P<0.01），網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不一致。見表3。

3 討 ?論

生物信息學(xué)分析可為認(rèn)識(shí)蛋白結(jié)構(gòu)及功能研究提供線索。隨著生物技術(shù)和信息技術(shù)的發(fā)展，新的生物信息學(xué)具有經(jīng)濟(jì)、便利、快捷的特點(diǎn)，可以為科學(xué)研究提供有價(jià)值的信息。本研究利用生物信息學(xué)軟件，對(duì)EBV陽(yáng)性和EBV陰性的BL細(xì)胞系相關(guān)特征進(jìn)行了研究，初步篩選出表達(dá)差異基因，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，為深入開展相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，上調(diào)基因參與的生長(zhǎng)因子活性通路（GO：0008083）刺激腫瘤的發(fā)生。孕酮受體為乳癌生長(zhǎng)因子活性的潛在指標(biāo)，有研究表明原發(fā)性乳癌孕酮受體缺乏與預(yù)后不良相關(guān)，低孕酮受體狀態(tài)可作為乳癌腫瘤細(xì)胞中活化生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)的指標(biāo)，因此可以用于侵襲性腫瘤表型對(duì)抗激素治療[12]。據(jù)此，上調(diào)基因參與的生長(zhǎng)因子活性通路可能對(duì)BL的治療和預(yù)后有著重要的作用。上調(diào)基因參與的調(diào)控肝素結(jié)合通路（GO：0008201）可促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化[13]。本文研究中的上調(diào)基因參與調(diào)控的肝素結(jié)合通路也可能與促進(jìn)BL的分化生長(zhǎng)有關(guān)，刺激了腫瘤的發(fā)生。上調(diào)基因參與的細(xì)胞外間隙通路（GO：0005615）為細(xì)胞之間的電耦合，由稱為間隙連接的質(zhì)膜相互作用而介導(dǎo)[14]。哺乳動(dòng)物心臟的主要連接蛋白是連接蛋白43，連接蛋白43含量的降低是心臟病的一般致病特征，并且其他連接蛋白類型的表達(dá)水平的變化可能有助于改變患病心臟的電生理功能。細(xì)胞外間隙通路影響細(xì)胞的電生理功能，這是否意味著電生理功能也對(duì)BL的發(fā)生發(fā)展有著重要作用，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。上調(diào)基因參與片狀偽足通路（GO：0030027），轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處位點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞在其通過(guò)血管期間受到血流動(dòng)力學(xué)剪切力，片狀偽足通路可以減少其通過(guò)血液轉(zhuǎn)移的阻力[15]。BL通過(guò)淋巴途徑轉(zhuǎn)移，片狀偽足通路對(duì)淋巴液的剪切力可能對(duì)其也有一定的影響，導(dǎo)致了BL的轉(zhuǎn)移，上調(diào)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。上調(diào)基因參與鈣介導(dǎo)的信號(hào)通路（GO：005084），有研究結(jié)果表明線粒體裂變與細(xì)胞溶質(zhì)鈣信號(hào)通路形成正反饋環(huán)，促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞自噬[16]。線粒體裂變與細(xì)胞溶質(zhì)鈣信號(hào)通路形成的正反饋環(huán)也可能參與了BL細(xì)胞的自噬，但這并不一定意味著其會(huì)下調(diào)BL的發(fā)生。上調(diào)基因參與鉀離子跨膜運(yùn)輸通路（GO：0071805），有學(xué)者進(jìn)行的熒光和膜片鉗實(shí)驗(yàn)表明，電壓可以驅(qū)使分子插入和離開脂質(zhì)雙層，從而打開和關(guān)閉鉀離子的傳輸，進(jìn)而影響腫瘤的形成[17]。下調(diào)基因參與伽馬微管蛋白結(jié)合通路（GO：0043015），在果蠅卵母細(xì)胞分裂的前中期（Ⅰ期）中雙極紡錘體組裝和動(dòng)粒微管附著需要伽馬微管蛋白通路[18-19]。這表明伽馬微管蛋白通路可能與祖細(xì)胞的分裂增殖有關(guān)，進(jìn)而抑制腫瘤的生成。下調(diào)基因參與poly（A）?RNA結(jié)合通路（GO：0044822），Poly（A）RNA結(jié)合蛋白以高親和力和特異性結(jié)合聚腺苷RNA，并出現(xiàn)了許多新的作用，這些作用有助于基因表達(dá)的微調(diào)[20]。結(jié)合本研究結(jié)果認(rèn)為其應(yīng)該與BL的下調(diào)有關(guān)。下調(diào)基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜通路（GO：0005789），有研究表明蘿卜硫素是一種天然存在的化學(xué)預(yù)防劑，通過(guò)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有效抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜通路被認(rèn)為可能是蘿卜硫素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的最重要機(jī)制[21]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜通路參與了腫瘤細(xì)胞凋亡，這與BL發(fā)生的下調(diào)有關(guān)。下調(diào)基因參與蛋白酶體調(diào)節(jié)粒子通路（GO：0008541），蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞死亡和病變。真核生物中的蛋白質(zhì)降解途徑主要分為蛋白酶體介導(dǎo)的降解和溶酶體介導(dǎo)的降解，目前蛋白酶體可作為癌癥的治療靶標(biāo)[22]，今后BL的治療可能要與蛋白酶體調(diào)節(jié)粒子通路相聯(lián)系。下調(diào)基因參與逆行性小囊泡運(yùn)輸通路（GO：0006890），高爾基體是分泌途徑的中心分選和生物合成中樞，并且使用囊泡運(yùn)輸來(lái)回收酶[23]。若逆行性小囊泡運(yùn)輸通路機(jī)制發(fā)生損傷，則高爾基體功能出現(xiàn)損傷進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本文通過(guò)對(duì)DEGs進(jìn)行功能和通路分析及蛋白質(zhì)相互作用分析，篩選出ACACB、VEGFA、YARS、IGF1、CTTN、F2、CDH1、UBE2N、H6PD以及PRPF19基因作為該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因，這些關(guān)鍵基?因主要參與了生長(zhǎng)因子激活信號(hào)通路、鉀離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路、伽馬微管蛋白結(jié)合信號(hào)通路等，并可能在BL的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。CDH1、PRPF19、UBE2N在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出的差異與本文結(jié)果相符合。CDH1為抑癌基因，其突變與多種腫瘤相關(guān)，CDH1敲除可能會(huì)影響乳腺上皮細(xì)胞的增殖分化，干擾T細(xì)胞的激活化生[24]。推測(cè)CDH1可能影響了T細(xì)胞的代謝通路，與免疫應(yīng)答通路有相互作用關(guān)系，其突變大大增加了BL發(fā)生的可能性。PRPF19突變可導(dǎo)致RNA末端的剪接紊亂并下調(diào)RNA表達(dá)，推測(cè)EBV可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞中PRPF19的表達(dá)，干擾正常細(xì)胞的分化代謝，進(jìn)而影響B(tài)L細(xì)胞的凋亡[25]。UBE2N是一種泛素結(jié)合酶，泛素蛋白酶體途徑是目前己知的所有真核生物體內(nèi)具有高度選擇性的最為重要的蛋白質(zhì)降解途徑，其突變?cè)贐L中影響了蛋白質(zhì)的降解[26]。本文結(jié)果顯示，F(xiàn)2、H6PD、VEGFA、YARS的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是其網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果不相符，可能與樣本量不足有關(guān)。F2為一種凝血因子，EBV可抑制其在BL中的表達(dá)，影響凝血因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可能與部分BL病人的出血傾向有關(guān)[27]。本文結(jié)果還顯示，H6PD在EBV陽(yáng)性細(xì)胞系中低表達(dá)，H6PD與細(xì)胞中物質(zhì)代謝有關(guān)，EBV可能通過(guò)抑制其表達(dá)，導(dǎo)致正常細(xì)胞中物質(zhì)代謝紊亂，影響B(tài)L細(xì)胞的凋亡。VEGF是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，在體外可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管增生，增加BL的新生血管。YARS是氨酰-tRNA合成酶，參與tRNA的合成，影響B(tài)L的核酸合成代謝，對(duì)BL可能有重要意義[28]。

綜上所述，EBV在BL中引起的上述基因表達(dá)差異可能影響B(tài)L的細(xì)胞間連接而影響其轉(zhuǎn)移，影響DNA的損傷后修復(fù)功能而影響B(tài)L的發(fā)生。但本文研究由于樣本量的限制，結(jié)果可能存在一定的局限性，需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探討與BL發(fā)生發(fā)展相關(guān)的DEGs。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）