基于適配體技術(shù)的熒光傳感器檢測甲拌磷農(nóng)藥殘留

王榮華　朱成龍　紀(jì)茜茜

[摘要]甲拌磷作為一種有機(jī)磷農(nóng)藥，因在農(nóng)業(yè)種植中被廣泛使用，對環(huán)境及人畜健康造成了許多危害，建立快速、靈敏的甲拌磷農(nóng)藥殘留檢測方法具有重要的意義。本文基于適配體技術(shù)，結(jié)合FAM和納米金組建了熒光傳感器，對甲拌磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，并對水樣進(jìn)行了加標(biāo)回收驗(yàn)證。結(jié)果表明，本方法的特異性強(qiáng)、靈敏度好、檢測過程耗時(shí)短、操作簡便，可用于甲拌磷農(nóng)藥殘留的實(shí)際檢測，對于檢測其他有機(jī)磷農(nóng)藥具有較大潛力。

[關(guān)鍵詞]適配體技術(shù);熒光傳感器;甲拌磷;農(nóng)藥殘留

中圖分類號：TS207

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190411

我國作為農(nóng)業(yè)大國，由于農(nóng)藥的廣泛使用，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留引起的安全問題受到了大眾的廣泛關(guān)注。有機(jī)磷農(nóng)藥是當(dāng)下現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中應(yīng)用最廣泛的化學(xué)農(nóng)藥之一，因其活性高、使用方便、成本低廉，常用于防治蜘蛛、螨蟲等昆蟲的咀嚼啃食1-21。然而許多有機(jī)磷農(nóng)藥具有高毒性，對人類和動物的安全構(gòu)成嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)B1。甲拌磷是一種高毒的有機(jī)磷農(nóng)藥，國家已嚴(yán)格限制其登記及使用，但其在土壤、水源等環(huán)境中的殘留仍會對人體健康和生態(tài)環(huán)境造成危害。作物、環(huán)境樣品中甲拌磷殘留的檢測對維護(hù)社會公共安全具有非常重要的意義。目前農(nóng)藥的檢測大多依賴各種色譜分析方法，這些色譜分析方法具有高靈敏度和準(zhǔn)確性，但其對精密儀器、耗時(shí)的樣品預(yù)處理和訓(xùn)練有素的人員的需求，限制了其在現(xiàn)場快速檢測中的應(yīng)用4。相比于色譜法檢測，適配體傳感器方法相較于傳統(tǒng)方法更方便、經(jīng)濟(jì)，可以實(shí)現(xiàn)快速、特異和高靈敏度的現(xiàn)場檢測。適配體大多是短的單鏈寡核苷酸（RNA或DNA），對于目標(biāo)物的結(jié)合具有高親和力和選擇性，與抗體相比，適配體具有特異性高、分子量小、靶點(diǎn)范圍廣、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。熒光檢測具有靈敏度高、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方便、響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)了一種6-羧基熒光素（FAM）和納米金（AuNPs）結(jié)合的熒光適配體傳感器，用于檢測甲拌磷農(nóng)藥殘留71。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

有機(jī)磷農(nóng)藥適配體序列參考Zhang等8）的研究，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，ssDNA適配體序列為5’-FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3’。

氯化鈉（NaCl）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸（HCl）、氯化鉀（KCl）、氯金酸（HAuC4·4H20）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲拌磷、毒死蜱、啶蟲脒、吡蟲啉、馬拉硫磷、敵敵畏農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：AccuStandard公司。

1.2主要設(shè)備

UV-3600PLUS型紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司;BSA124S型電子天平：賽多利斯公司;F-7000型熒光分光光度計(jì)：日本電子株式會社;渦旋振蕩器：德國艾卡公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1納米金的制備

所有制備用的玻璃器皿都用王水（3份濃鹽酸加1份濃硝酸配置而成）浸泡過夜，然后用超純水清洗，在使用前烘干。采用經(jīng)典的檸檬酸鹽還原法制備了平均直徑為13nm的AuNPs'。將HAuCl4（1.0mmol/L、100mL）加熱至沸騰，然后在快速攪拌下添加檸檬酸鈉（38.8mmol/L、10mL），混合物的顏色從淡黃色變?yōu)榫萍t色。煮沸15min后停止加熱，使溶液自然冷卻至室溫，制備得到的AuNPs在49C下儲存?zhèn)溆?。將制備的膠體金水溶液滴加10μL至覆有碳膜的銅網(wǎng)上，烘干后采用透射電鏡（JEM2110，200kV）對金納米粒子進(jìn)行表征，計(jì)算直徑約為13nm。根據(jù)朗伯一比爾定律，利用519nm處的吸光度和13nm的AuNPs消光系數(shù)為2.7x10L/（mol.cm）計(jì)算得出AuNPs的濃度約為13.0nmol/L"0。

2.2甲拌磷的檢測

在1.5mL的離心管中加入40μL、0.2μmol/L的FAM-Apt，20μL、2mg/L不同濃度的甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)嶋H樣品和100μL、pH為7.2的50mmol/L的Tris-HCl（含10mmol/L的NaCl、10mmo/L的KCl），混勻后分別反應(yīng)20min，加入40μL、2.5nmol/L的AuNPs混勻后反應(yīng)10min，測定527nm處的熒光強(qiáng)度值，整個(gè)檢測過程大約耗時(shí)30min。

2.3特異性試驗(yàn)

通過分別添加毒死蜱、啶蟲脒、吡蟲啉、馬拉硫磷、敵敵畏等農(nóng)藥對本方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證。在1.5mL的離心管中加入40μL、0.2μmol/L的FAM-Apt，分別加入20μL、2mg/L所有不同農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液和100μL、pH值為7.2的50mmol/L的Tris-HC（含10mmol/L的NaCl、10mmol/L的KCl），混勻后分別反應(yīng)20min，加入40μL、2.5nmol/L的AuNPs混勻后反應(yīng)10min，測定527nm處的熒光強(qiáng)度值川。

2.4水樣實(shí)際樣品加標(biāo)回收率測定

采集江南大學(xué)內(nèi)小蠡湖湖水進(jìn)行加標(biāo)回收率的測定。該水樣經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，分別添加1mg/L、2mg/L、3mg/L的甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行527nm處的熒光強(qiáng)度值的測定，每個(gè)加標(biāo)濃度重復(fù)測定3次，計(jì)算各個(gè)濃度的加標(biāo)回收率。

3結(jié)果與分析

3.1甲拌磷的熒光檢測原理

熒光傳感器檢測甲拌磷原理見圖1。單鏈DNA會通過AuNPs和氮原子之間的配位作用和靜電相互作用吸附在帶負(fù)電的AuNPs表面，F(xiàn)AM是一種在497nm激發(fā)、在527nm處發(fā)射熒光的有機(jī)小分子熒光染料，而AuNPs在480～540nm有很強(qiáng)的紫外吸收。將修飾了FAM的有機(jī)磷農(nóng)藥的核酸適配體（FAM-Apt）和AuNPs混合，基于單鏈DNA和AuNPs之間的吸附作用及FAM與AuNPs之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，F(xiàn)AM的熒光會被AuNPs猝滅。如果在體系中加入目標(biāo)物有機(jī)磷農(nóng)藥，F(xiàn)AM-Apt會和有機(jī)磷農(nóng)藥特異性結(jié)合，從而使FAM-Apt從AuNPs表面脫離，F(xiàn)AM的熒光出現(xiàn)一定恢復(fù)，恢復(fù)程度與甲拌磷的濃度成比例關(guān)系，可以通過檢測計(jì)算熒光恢復(fù)值對甲拌磷進(jìn)行定量。

3.2納米金溶液的表征

納米金的透射電鏡圖見圖2。本實(shí)驗(yàn)制備得到的納米金呈統(tǒng)一的圓球形，在水溶液中有良好的分散性，對納米金的直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出納米金直徑在13nm左右。納米金的紫外吸收光譜見圖2，本實(shí)驗(yàn)制備得到的納米金在520nm處有最大的紫外吸收峰。

3.3反應(yīng)條件優(yōu)化

由于適配體和目標(biāo)物的結(jié)合需要一定的時(shí)間，因此對于FAM-Apt和甲拌磷的孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，分別孵育不同時(shí)間的熒光結(jié)果見圖4。另外，單鏈DNA即適配體對AuNPs的吸附程度與時(shí)間有關(guān)，對AuNPs的猝滅時(shí)間也進(jìn)行了優(yōu)化，加入AuNPs后反應(yīng)不同時(shí)間的熒光猝滅結(jié)果見圖5。同濃度的納米金的猝滅效果不同，也影響目標(biāo)物存在時(shí)的熒光恢復(fù)程度，納米金的優(yōu)化結(jié)果見圖6。FAM-Apt和甲拌磷之間的相互作用在20min后達(dá)到平衡，加人10min后AuNPs不再猝滅FAM熒光，納米金濃度為2.5nmol/L，加人甲拌磷后的熒光恢復(fù)最強(qiáng)。分別采用20min、10min作為反應(yīng)時(shí)間，納米金濃度選擇2.5nmol/L。

3.4甲拌磷的熒光分析靈敏度及選擇性

在最佳條件下，研究了不同濃度甲拌磷下的熒光變化值，結(jié)果見圖7。據(jù)圖7可知，隨著甲拌磷濃度的增加，F(xiàn)AM在527nm處的熒光值逐漸升高，以527nm處的熒光變化值△F對甲拌磷濃度作圖。當(dāng)甲拌磷濃度為0.5～5mg/L時(shí)，△F與甲胺磷濃度呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=53.904x+5.2116，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9944，檢測限為0.27mg/L（3Sd/k），甲拌磷濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8。為了驗(yàn)證本方法的特異性，選擇了5種常用的農(nóng)藥進(jìn)行特異性檢測，分別是毒死蜱、啶蟲脒、吡蟲啉、馬拉硫磷、敵敵畏，檢測步驟同甲拌磷，結(jié)果見圖9，加入其他幾種農(nóng)藥不會引起527nm處出現(xiàn)明顯的熒光變化，說明該方法對于甲拌磷的特異性較好，能夠?qū)崿F(xiàn)對甲拌磷的特異性檢測。

3.5水樣加標(biāo)回收率測定

選取了小蠡湖的湖水進(jìn)行加標(biāo)回收測定。加標(biāo)前，對前處理過的湖水樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，過膜后的湖水樣品對基本不會造成熒光變化，說明該前處理方法可基本消除湖水樣品的基質(zhì)效應(yīng)影響。前處理后的湖水樣品作為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)檢測，分別在不同加標(biāo)濃度下重復(fù)3次，計(jì)算得到各個(gè)靶標(biāo)的回收率見表1。不同加標(biāo)濃度下的平均回收率為93.5%～112.4%，說明該方法在實(shí)際樣品檢測中具有可行性。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用修飾了FAM熒光染料的適配體和納米金建立了一種基于適配體技術(shù)的熒光傳感器，并應(yīng)用于甲拌磷農(nóng)藥的快速檢測。本方法在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，應(yīng)用于湖水樣品檢測得到了理想的加標(biāo)回收率，具有良好的應(yīng)用前景，在其他有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測中也具有很大潛力。由于FAM熒光染料的光漂白較為嚴(yán)重，同時(shí)容易受到檢測體系的干擾，該方法的線性范圍不夠廣，靈敏度有待提高，但相比于大型的儀器分析檢測方法，該方法的耗時(shí)較短、成本較低、檢測簡單，在實(shí)際樣品的快速篩查中有很大的發(fā)展空間，為適配體技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析檢測領(lǐng)域，尤其在快速檢測方面的應(yīng)用提供了發(fā)展思路。

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