5種植物乙醇提取物抑菌殺蟲活性

李波 趙永田 高甜甜 金洪 陶科 侯太平

摘 要：【目的】研究5種植物乙醇提取物的抑菌殺蟲活性，并對(duì)殺蝗活性最高的鬧羊花提取物進(jìn)行活性物質(zhì)的分離，為進(jìn)一步研究其殺蝗活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和其作用機(jī)理提供參考?！痉椒ā亢Y選鐵棒錘Aconitum Pendulum、肉豆蔻Myristica fragrans Houtt、（紫丱子）紫鉚Butea monosperma（Lan.）Kuntze、翼首草Pterocephalus hookeri和鬧羊花Rhododendron mole 5種植物乙醇提取物，分別測(cè)定其對(duì)植物病原真菌的抑制活性，對(duì)蚜蟲和東亞飛蝗的毒力;采用連續(xù)分級(jí)萃取法和柱層析法分離鬧羊花的殺蝗活性物質(zhì)?！窘Y(jié)果】肉豆蔻提取物在1 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下對(duì)番茄綿腐病菌、蘋果輪紋病菌和水稻紋枯病菌的抑制率分別為75.23%、77.78%和88.85%;48 h后鬧羊花提取物在2 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下對(duì)蚜蟲的致死率為55.38%，10 000 mg·L-1下的致死率為100%;鬧羊花提取物在10 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下，24 h后對(duì)蝗蟲的致死率為44.83%，96 h后的致死率為86.96%。從鬧羊花提取物中分離得到的活性物質(zhì)流分Ⅲ-2-2，在1 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下，24 h后對(duì)蝗蟲的致死率為53.57%，120 h后的致死率為90.48%?！窘Y(jié)論】肉豆蔻提取物的抑菌活性最高;鬧羊花提取物對(duì)蚜蟲和蝗蟲的毒殺活性最高;鬧羊花提取物中殺蝗活性物質(zhì)集中在石油醚萃取物和二氯甲烷萃取物，從二氯甲烷萃取物中分離得到對(duì)蝗蟲毒殺活性最高的流分Ⅲ-2-2。

關(guān)鍵詞：植物源農(nóng)藥;抑菌活性;殺蟲活性;鬧羊花;東亞飛蝗

中圖分類號(hào)：Q 43文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）04-451-05

Abstract： 【Objective】Ethanol extracts of 5 species of plants were analyzed for possible antibacterial and/or insecticidal applications in disease control. 【Method】 Aconitum Pendulum， nutmeg （Myristica fragrans Houtt）， Butea monosperma （Lan.） Kuntze， Pterocephalus hookeri， and Rhododendron molle were selected for the extraction. The inhibitory activities of the extracts against plant pathogenic fungi as well as the virulence to aphids and locusts were determined. Subsequently， the greatest locust-killing capacity demonstrated by the R. molle extract was subjected to a step-wise fractional extraction and column separations to isolate active substances. 【Result】The nutmeg extract applied at 1 000 mg·L-1 level inhibited the growth of Pythium aphanidermatum， Physalospora berengeriana and Rhizoctonia solani at 75.23%， 77.78% and 88.85%， respectively. The R. molle extract showed the lethality on aphids at a rate of 55.38% with the dosage of 2 000 mg·L-1 and 100% with 10 000 mg·L-1in 48h; while that on locusts， 44.83% in 24h and 86.96% in 96h with 10 000 mg·L-1. At 1 000 mg·L-1 dosage， the active fraction， III-2-2， isolated from the extract rendered the lethal rates on locusts of 53.57% in 24h and 90.48% in 120h. 【Conclusion】The antibacterial activity of nutmeg extract was the highest among all extracts; the R. molle extract displayed the highest toxicity on aphids and locusts; most of the active substances in the extracts were petroleum ether and dichloromethane soluble; and， III-2-2 obtained from the dichloromethane fraction had the highest potency toward locusts.

Key words： botanical pesticides; antibacterial activity; insecticidal activity; Rhododendron molle; Locusta migratoria manilensis （Meyen）

0 引言

【研究意義】東亞飛蝗隸屬于昆蟲綱、直翅目、斑翅蝗科，是一種雜食性昆蟲，其分布范圍十分廣泛，危害著我國(guó)的農(nóng)牧業(yè)。從自然界發(fā)掘有害生物的克生生物因子（微生物源、植物源、動(dòng)物源）對(duì)病蟲害進(jìn)行綜合防治，是目前生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[1];植物源農(nóng)藥的有效成分是植物體中的次生代謝產(chǎn)物，如生物堿類、黃酮類、萜烯類、酚類等，具有環(huán)境友好、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性、作用方式特異、促進(jìn)作物生長(zhǎng)并提高抗病性、種類多、開發(fā)途徑多等特點(diǎn)[2]，從植物中分離純化具有農(nóng)藥活性的新物質(zhì)，以此先導(dǎo)化合物為結(jié)構(gòu)模板，進(jìn)行結(jié)構(gòu)的多級(jí)優(yōu)化，創(chuàng)制高效低毒新農(nóng)藥是植物農(nóng)藥的研究重點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鬧羊花[3]Rhododendron molle為杜鵑花科、杜鵑花屬、羊躑躅亞屬的落葉灌木，通常稱之為黃杜鵑，又名羊躑躅，是中國(guó)特有的一種有毒植物，其殺蟲活性已有很多研究[4-6]，例如對(duì)黏蟲、菜青蟲、稻飛虱、小菜蛾、二化螟等均有一定的活性。【本研究切入點(diǎn)】鬧羊花對(duì)蝗蟲的活性研究未有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了篩選出有應(yīng)用價(jià)值的植物源農(nóng)藥，本研究先將5種植物乙醇提取物對(duì)植物病原真菌的抑制活性、對(duì)蚜蟲和東亞飛蝗的毒殺活性進(jìn)行初步篩選，確定鬧羊花乙醇提取物為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行分離及活性跟蹤，以期得到效果好的殺蝗蟲活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料

1.1.2 供試病原真菌

供試病原真菌為水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani、小麥赤霉病菌Gibberella zeae、蘋果輪紋病菌Physalospora berengeriana、玉米小斑病菌Helminthosporium maydis、 棉花枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp. vasinfectum、馬鈴薯晚疫病菌Phytopthora infestans、番茄綿腐病菌Pythium aphanidermatum，以上病原菌種均來自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.1.3 供試?yán)ハx

棉蚜Aphis gossypii Glover，采自成都近郊大豆苗田，試驗(yàn)當(dāng)天采取。

東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis Meyen三齡若蟲，購于云南省昆明市蝗蟲養(yǎng)殖基地;試蟲置于大飼養(yǎng)籠，在室內(nèi)溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（70±10）%的條件下，用新鮮竹葉飼喂，試驗(yàn)前進(jìn)行饑餓處理24 h。

1.2 方法

1.2.1 乙醇提取物的制備

乙醇浸提[7]：植物樣品陰干后用打粉機(jī)粉碎，采用浸提法將樣品粉末按照1∶10（W∶V）的比例用95%乙醇水溶液浸泡，恒溫40℃下攪拌24 h，重復(fù)3次后將提取液合并，減壓濃縮后得到浸膏狀提取物，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鬧羊花提取物的4種萃取物制備

鬧羊花的乙醇提取物拌以適量硅藻土，混合均勻后于室內(nèi)陰干，依次按石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及乙醇的順序萃取完全，減壓濃縮萃取液，得到的4種浸膏置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 鬧羊花殺蝗蟲活性成分的分離

硅膠H用作固定相，均采用濕法裝柱，干法上樣，薄層色譜檢測(cè)合并Rf值相同的流分，用紫外燈和碘顯標(biāo)記。第一次柱層析分離：柱徑為50 mm，粗分二氯甲烷萃取物，分別用正己烷∶乙酸乙酯（2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）及純乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，最后用無水乙醇洗脫極性大的部分，收集成4段，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ?；认x毒力測(cè)定后，對(duì)活性最高的第Ⅲ段進(jìn)行再分析。第二次柱層析分離：柱徑為25 mm，分別用正己烷∶乙酸乙酯（1∶1、1∶2、1∶3）及純乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，收集成3段，分別為Ⅲ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3?；认x毒力測(cè)定后，對(duì)活性最高的第Ⅲ-2段進(jìn)行再分析。第三次柱層析：柱徑為2.0 mm，分別用正己烷∶乙酸乙酯（1∶2、1∶3）進(jìn)行梯度洗脫，收集成2段，分別為Ⅲ-2-1、Ⅲ-2-2?；认x活性測(cè)定后，對(duì)活性最高的第Ⅲ-2-2段進(jìn)行去雜純化。薄層色譜制備純化：Ⅲ-2-2段在層析板顯示主成分周圍有少量Rf值接近的雜質(zhì)譜帶，因此利用薄層色譜制備法純化;硅膠GF254厚度1 mm、薄板規(guī)格10 cm×20 cm，將Ⅲ-2-2段溶液均勻平鋪至薄層制備板上，以二氯甲烷∶甲醇（10∶1）為展開劑，待主成分與其他色譜帶較明顯分開后，刮板浸提得到單一色譜帶物質(zhì)。

1.3 生物活性測(cè)定

抑菌活性的測(cè)定[8]：采用生長(zhǎng)速率法;分別稱取不用植物乙醇提取物50 mg溶于1 mL丙酮，在無菌操作臺(tái)上與已滅菌的1‰的吐溫水（Tween-80）4 mL混合，取混液1 mL于49 mL的PDA培養(yǎng)基，搖勻得到質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的藥液;均勻鋪平板，待培養(yǎng)基凝固后，在平板中央接上菌餅，菌餅直徑為0.8 cm，菌絲面向下，置于28℃恒溫真菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);空白對(duì)照為不含藥物的丙酮，每種藥液3組重復(fù)，當(dāng)空白對(duì)照菌落直徑長(zhǎng)到6.0 cm左右，十字交叉法測(cè)量平板的菌落直徑，計(jì)算平均相對(duì)抑菌率和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

相對(duì)抑菌率（%）=[（空白組菌落平均直徑-處理組菌落平均直徑）/（空白組菌落平均直徑-0.8 cm）]×100%

蚜蟲毒力測(cè)定：采用直接浸液法測(cè)定毒力[9-10];稱取適量不同植物乙醇提取物與等量吐溫-80混勻，加少量蒸餾水充分乳化后，再用蒸餾水梯度稀釋至2 000、5 000、10 000 mg·L-1;空白對(duì)照為不含藥物的試液，挑除部分病弱個(gè)體，選取大小適中的健康無翅成蚜，將等大的葉片浸入藥液2～3 s后取出瀝干，將帶蟲面向上置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，用穿孔的保鮮膜包住防止蚜蟲爬失，置于室溫（25℃）下 48 h 后觀察結(jié)果;每組30只蚜蟲，每種藥液3組重復(fù)，計(jì)算平均校正死亡率和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

平均死亡率（%）=（死亡蟲數(shù)/供試總蟲數(shù)）×100%

校正死亡率（%）=[（處理組平均死亡率-對(duì)照組平均死亡率）/（1-空白組平均死亡率）]×100%

蝗蟲毒力測(cè)定：采用浸蟲浸葉法測(cè)定[11-12];稱取適量藥物溶解于1 mL二甲基亞砜（DMSO），用1‰的吐溫水（Tween-80）稀釋為所需濃度的藥液50 mL;將新鮮竹葉完全浸入藥液，取出瀝干水，放入蝗蟲籠，再將蝗蟲浸入藥液，1～2 s后取出立即置于籠內(nèi)，每個(gè)籠子內(nèi)15只蝗蟲，空白對(duì)照為不含藥物的試液，每種藥液3組重復(fù)，每天喂食一次新鮮竹葉，在空白組無異常死亡的條件下，每隔24 h觀察蝗蟲的死亡狀況，計(jì)算平均校正死亡率和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

平均死亡率（%）=（死亡蟲數(shù)/供試總蟲數(shù)）×100%

校正死亡率（%）=[（處理組平均死亡率-對(duì)照組平均死亡率）/（1-空白組平均死亡率）]×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel、DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，采用Duncan′s新復(fù)極差法分析不同處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物乙醇提取物抑菌殺蟲活性篩選

2.1.1 不同植物乙醇提取物對(duì)病原真菌的抑制活性

分別對(duì)各植物乙醇提取物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

由表1可見，肉豆蔻乙醇提取物比其他4種植物對(duì)7種植物病原真菌有更顯著的抑制效果。1 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下，肉豆蔻乙醇提取物對(duì)病原真菌的抑制率較高，對(duì)番茄綿腐病菌、蘋果輪紋病菌和水稻紋枯病菌的抑制率分別達(dá)到了75.23%、77.78%和88.85%，鬧羊花等植物乙醇提取物也對(duì)部分病原真菌有一定的抑制活性。

2.1.2 不同植物乙醇提取物對(duì)蚜蟲的毒力測(cè)定

分別對(duì)5種植物乙醇提取物進(jìn)行蚜蟲毒力測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，5種植物乙醇提取物對(duì)蚜蟲都具有一定的毒殺活性，鬧羊花乙醇提取物的殺蚜活性最高，48 h后在2 000 mg·L-1的質(zhì)量濃度下致死率為 55.38%，在10 000 mg·L-1下對(duì)蚜蟲的致死率達(dá)到100%。

2.1.3 不同植物乙醇提取物對(duì)蝗蟲的毒力測(cè)定結(jié)果

分別對(duì)5種植物乙醇提取物進(jìn)行蝗蟲毒力測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，鬧羊花乙醇提取物對(duì)蝗蟲的毒殺活性最高，在供試質(zhì)量濃度為10 000 mg·L-1時(shí)，24 h后對(duì)蝗蟲的致死率為44.83%，96 h后的致死率為86.96%，因此選擇鬧羊花提取物進(jìn)行殺蝗活性成分的分離及追蹤研究。

2.2 鬧羊花殺蝗蟲活性物質(zhì)的分離及活性測(cè)定

2.2.1 不同極性萃取物對(duì)蝗蟲的毒力

分別對(duì)鬧羊花乙醇提取物的4種不同極性萃取物進(jìn)行蝗蟲毒力測(cè)定，結(jié)果如表4所示。4種萃取物對(duì)蝗蟲毒力測(cè)定結(jié)果如表4所示，乙酸乙酯萃取物和乙醇萃取物的毒殺活性偏低，二氯甲烷萃取物和石油醚萃取物對(duì)蝗蟲的毒殺活性較高;且二氯甲烷萃取物高于石油醚萃取物，在4 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下，96 h后對(duì)蝗蟲的致死率分別為88.98%和70.37%，因此選擇二氯甲烷萃取物作為接下來的分離對(duì)象。

2.2.2 柱層析分離各流分對(duì)蝗蟲的毒力

鬧羊花乙醇提取物的二氯甲烷萃取物經(jīng)過三次硅膠柱層析分離得到不同極性的流分，對(duì)各流分進(jìn)行蝗蟲毒力測(cè)定，結(jié)果如表5～7所示。

由表5可知，第一次柱層析分離得到4段流分，第Ⅲ段對(duì)蝗蟲的致死率對(duì)比其他3段有顯著差異，毒殺活性最高，2 000 mg·L-1的質(zhì)量濃度下，24 h和96 h后對(duì)蝗蟲的致死率分別為40%、95.83%。

由表6可知，第二次柱層析分離所得3段流分Ⅲ-1、Ⅲ-2和Ⅲ-3，對(duì)蝗蟲毒殺活性最高的為Ⅲ-2，2 000 mg·L-1的質(zhì)量濃度下24 h后對(duì)蝗蟲的致死率為76.67%，72 h后的致死率達(dá)到100%。

由表7可知，第三次柱層析分離所得兩段流分Ⅲ-2-1和Ⅲ-2-2，對(duì)蝗蟲致死率高的是Ⅲ-2-2，1 000 mg·L-1的質(zhì)量濃度下24 h后對(duì)蝗蟲的致死率為53.57%，120 h后的致死率達(dá)到90.48%。

3 討論與結(jié)論

肉豆蔻抑制真菌活性的有關(guān)研究很少，涉及農(nóng)藥方面的只有肉豆蔻甲醇提取物中分離肉豆蔻木酚素的一篇報(bào)道[13]，因此本研究抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉豆蔻對(duì)植物病原真菌方面的防治功效有一定深入研究?jī)r(jià)值。鬧羊花作為殺蟲植物很早就在我國(guó)使用，其提取物對(duì)很多農(nóng)、林、牧及衛(wèi)生害蟲有明顯的胃毒、觸殺等作用，目前的研究表明鬧羊花殺蟲的活性成分多為四環(huán)二萜類化合物，鬧羊花素-Ⅲ是主要的活性成分之一，鬧羊花對(duì)斜紋夜蛾、小菜蛾、馬鈴薯甲蟲等的活性研究有很多[14-16]，但是卻沒有對(duì)蝗蟲毒殺活性的相關(guān)報(bào)道。在許多具有殺蟲活性的植物中，同一種植物對(duì)不同害蟲的毒性有差異，某種植物對(duì)特定的害蟲具有特異的作用效果，所以研究鬧羊花對(duì)直翅目的蝗蟲活性以及活性物質(zhì)的分離有一定的意義。

本研究對(duì)5種植物的乙醇提取物進(jìn)行了初步的抑菌殺蟲活性篩選，測(cè)定其對(duì)7種病原真菌的抑制活性，結(jié)果顯示肉豆蔻乙醇提取物對(duì)7種病原真菌的抑制率明顯較高，1 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率達(dá)到了88.85%;對(duì)蚜蟲的毒力測(cè)定結(jié)果顯示鬧羊花乙醇提取物的殺蚜活性很高，在2 000 mg·L-1的質(zhì)量濃度下48 h后致死率為55.38%，在10 000 mg·L-1下48 h后的致死率達(dá)到100%;浸蟲浸葉法測(cè)定了對(duì)東亞飛蝗的毒殺活性，結(jié)果顯示在質(zhì)量濃度為10 000 mg·L-1時(shí)，鬧羊花提取物24 h后對(duì)蝗蟲的致死率為44.83%，96 h后致死率為86.96%，對(duì)蝗蟲具有較高的毒殺活性。接著對(duì)鬧羊花乙醇提取物連續(xù)分步萃取得到4種萃取產(chǎn)物，蝗蟲毒力測(cè)定結(jié)果顯示其活性物質(zhì)主要集中在石油醚萃取物和二氯甲烷萃取物中，因二氯甲烷萃取物活性更高，對(duì)二氯甲烷萃取物進(jìn)行柱層析分離，并且跟蹤檢測(cè)不同流分殺蝗活性，得到的Ⅲ-2-2段活性物質(zhì)在1 000 mg·L-1質(zhì)量濃度下對(duì)蝗蟲的致死率24 h為53.57%，120 h后為90.48%。

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（責(zé)任編輯：林海清）