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    樹莓乙醇提取物抑菌活性研究

    2015-10-13 21:53:19劉亞紅張婷婷張敏
    湖北農(nóng)業(yè)科學 2015年18期
    關(guān)鍵詞:抑菌活性樹莓

    劉亞紅++張婷婷++張敏

    摘要: 研究以大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurous)、酵母(Yeast)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、黑曲霉(Aspergillums niger)、灰綠青霉(Penicillium glaucum)為供試菌,測定樹莓(Rubus chingii Hu)乙醇提取物的抑菌活性。結(jié)果表明,樹莓乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有比較顯著的抑菌效果;在一定溫度及pH范圍內(nèi),其抑菌率與時間呈正相關(guān);而在時間相同的情況下,其抑菌率與乙醇提取物濃度呈正相關(guān)。

    關(guān)鍵詞:樹莓(Rubus chingii Hu); 乙醇提取物; 抑菌活性

    中圖分類號:Q949.32;R151 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2015)18-4485-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.024

    樹莓(Rubus chingii Hu),薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus L),廣泛分布于江浙地區(qū)、以及南部沿海省份[1]。樹莓的果實極具經(jīng)濟價值與藥用價值,可以直接食用,也可以釀酒、做糖等;樹莓的藥用部位主要是其經(jīng)干燥處理后的果實,主要功效是補肝、固精等。樹莓果實中有大量樹莓酸、β-谷甾醇等活性物[2-4],有較為顯著的溫腎、抗氧化、延緩衰老功效[5-7]。

    而針對樹莓果實的提取物的抑菌功能研究則尚不多見,本研究將樹莓乙醇提取物的抑菌圈和最低抑菌濃度做為評估標準,測試樹莓果實的乙醇提取物對一些常見菌的抑菌能力[8],在此基礎(chǔ)上進一步測定在不同溫度、不同pH條件下樹莓乙醇提取液抑菌活性的變化規(guī)律。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    樹莓乙醇提取物,其中樹莓原料于2013年6月5~10日采集于江蘇鎮(zhèn)江地區(qū),以沸水煮5 min,陰涼干燥處風干,用粉碎機粉碎,過0.25 mm篩,密封存于冰箱備用。大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurous)、酵母(Yeast)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、黑曲霉(Aspergillums niger)、灰綠青霉(Penicillium glaucum)。試驗所需以上各菌種來自河北經(jīng)貿(mào)大學生物與食品實驗中心。

    恒溫培養(yǎng)箱(BPH-92722),購自上海精密儀器有限責任公司;高壓滅菌鍋(G154DW),為深圳博大精科有限責任公司產(chǎn)品;超凈無菌操作臺(VD-650),為北京華威興業(yè)科技有限公司產(chǎn)品;干燥箱(202A-1),為南京萊步科技有限公司產(chǎn)品;磁力攪拌機(FCH202-S),為上海弗魯克科學儀器公司產(chǎn)品;離心機(LW-250A),為浙江天恩儀器制造公司產(chǎn)品;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE2000E),為上??粕齼x器有限責任公司產(chǎn)品;另有酒精燈、三角瓶、培養(yǎng)皿等。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 制備乙醇提取物 取已經(jīng)制備好并過篩冷藏的樹莓100 g,充分溶解于500 mL體積分數(shù)為75%乙醇溶液中。用攪拌機充分攪拌1.5 h,再用離心機進行離心分離,過濾后得到樹莓乙醇提取液,以蒸發(fā)儀進行濃縮處理,減壓真空干燥,得到樹莓乙醇提取物備用。

    1.2.2 制備培養(yǎng)基 采用PDA培養(yǎng)基,取馬鈴薯300 g,洗凈,去除外皮,切塊,入鍋加水沸騰后,繼續(xù)煮20 min,以8層紗布過濾,將所得濾物取葡萄糖20 g,瓊脂20 g,攪拌均勻,定容至1 000 mL,置于滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min。

    1.2.3 制備菌懸液 將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母、匍枝根霉、黑曲霉、灰綠青霉接種于培養(yǎng)基,置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),活化36 h,使其處于指數(shù)生長期后期,再選取處于一環(huán)位置的菌種,以RPMI 1 640培養(yǎng)液制成每種菌種的菌懸液,調(diào)整菌液濃度至107~108 CFU/mL。

    1.2.4 制備濾紙片 取濾紙,用打孔器將其處理為半徑3 mm的圓形紙片,置于干燥箱,設(shè)置250 ℃進行滅菌處理,取出冷卻至常溫,浸入樹莓乙醇提取液,浸泡60 min,取出。

    1.2.5 測定抑菌圈 在無菌操作臺測定樹莓乙醇提取液抑菌效果。將PDA培養(yǎng)基置于微波爐2 min使其熔化并冷卻至常溫凝固,然后在其表面均勻涂抹107~108 CFU/mL濃度的菌液,再把樹莓乙醇提取液濾紙片貼放于涂抹菌液的培養(yǎng)基表面。每一菌種重復8次。在37 ℃恒溫箱里培養(yǎng)48 h,以濾紙片抑菌圈直徑描述樹莓乙醇提取液的抑菌效果。

    1.2.6 測定抑菌濃度 在10個試管中均注入3 mL液態(tài)培養(yǎng)基,然后在第1個試管里注入3 mL濃度為3.5 mg/mL的樹莓乙醇提取液,攪拌均勻;再從第1個試管抽取3 mL液體注入第2個試管,以相同的方法進行到第9個試管,從而使前9個試管中樹莓乙醇提取液濃度逐步下降,且容量維持在3 mL 。再把這9個試管均加入300 μL細菌,第10個試管不加細菌,為無菌對照。細菌培養(yǎng)后,考察樹莓乙醇提取液最小抑菌濃度。

    1.2.7 樹莓抑菌效果的影響因素 pH的影響:以NaOH改變培養(yǎng)基的pH,分別調(diào)節(jié)pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,測量每一種細菌在樹莓乙醇提取物作用下的抑菌濃度最小值。

    溫度的影響:取2 mL具有最小抑菌濃度的樹莓乙醇提取液注入三角瓶,每個三角瓶里分別加入200 μL每種菌種的菌懸液,分別在25、45、60、75 ℃水浴鍋中加熱30 min,測定每種被試菌種最小抑菌濃度的抑菌效果,測定溫度對樹莓乙醇提取物抑菌效果的影響。

    時間的影響:以去離子水將樹莓乙醇提取物稀釋到所需的濃度,以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種菌種作為被試菌,測定不同濃度下的抑菌效果與作用時間的關(guān)系。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樹莓乙醇提取物抑菌圈試驗結(jié)果

    由表1樹莓乙醇提取物抑菌圈試驗數(shù)據(jù)可知,樹莓乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉4種被試菌種均有抑菌效果,其中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為明顯,抑菌圈直徑達到12.75 mm,而抑菌效果相對小些的黑曲霉抑菌圈直徑也達到了6.45 mm。對酵母、匍枝根霉及灰綠青霉則未測出顯著抑菌效果。

    2.2 樹莓乙醇提取物最低抑菌濃度

    由表2可知,樹莓乙醇提取物具有較為明顯的抑菌效果。測量得到對各類被試菌種的抑菌濃度最小值,對大腸桿菌的抑菌濃度最小值為0.16 mg/mL,對枯草芽孢桿菌的抑菌濃度最小值為0.16 mg/mL,對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度最小值為0.34 mg/mL,對黑曲霉的抑菌濃度最小值為0.64 mg/mL。由綜合抑菌濃度最小值及表2可知,樹莓乙醇提取物對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果較好,而對灰綠青霉的抑菌效果則較弱。

    2.3 樹莓抑菌的影響因素

    2.3.1 pH的影響 由表3可知,當pH≤6.0時,均未發(fā)現(xiàn)被試菌種,說明抑菌效果顯著;pH為7.0時,部分被試菌種(酵母、匍枝根霉、灰綠青霉)開始檢出,說明樹莓乙醇提取物抑菌活性開始降低;pH為9.0時,所有被試菌種均被測出,說明樹莓乙醇提取物抑菌活性顯著下降。因此樹莓乙醇提取物抑菌活性在pH≤6.0時更容易發(fā)揮。

    2.3.2 溫度的影響 由表4可知,當溫度從25 ℃升高到75 ℃過程中,溫度對樹莓抑菌并無明顯影響。故可知,溫度對樹莓乙醇提取物的抑菌效果無明顯影響。

    2.3.3 時間的影響 選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種菌種作為被試菌,測定不同濃度情況下抑菌效果與作用時間的關(guān)系。圖1、圖2和圖3分別是3種被試菌種的抑菌率測定結(jié)果,其中橫坐標表示樹莓乙醇提取物濃度(mg/mL),縱坐標表示抑菌率(%)。

    由圖1-3數(shù)據(jù)可知,隨著作用時間的延長,樹莓乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種菌種抑菌率均有所提升,抑菌率與時間呈正相關(guān)。其中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為顯著,在濃度相同的情況下,樹莓乙醇提取物對金葡菌抑菌率顯著高于其他2種被試菌種。

    3 小結(jié)與討論

    樹莓的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有比較顯著的抑菌效果,對黑曲霉抑菌效果一般,而對酵母、匍枝根霉、灰綠青霉則沒有明顯效果;同時證實在一定溫度范圍及pH范圍之內(nèi)(75 ℃范圍內(nèi),pH 3.0~9.0),樹莓乙醇提取物的抑菌率與時間呈正相關(guān);而在時間相同的情況下,樹莓乙醇提取物的抑菌率則與乙醇提取物濃度正相關(guān)。

    基于植物的殺菌產(chǎn)品其主要成分均是復合抑菌成分,而作用的位點及機制也不盡相同,最大的優(yōu)勢是環(huán)保,是當前農(nóng)藥領(lǐng)域的研究熱點,本研究證明樹莓對各類細菌具有抑制效果,能夠在天然抑菌產(chǎn)品中發(fā)揮作用,發(fā)展前景可期,可以為植物殺菌產(chǎn)品的研發(fā)制作提供借鑒。

    同時由于天然植物的無公害農(nóng)藥的抑菌機理目前仍然處于初級研究階段,沒有系統(tǒng)的研究成果,研究的方式和方法尚需進一步探索,也需要其他相關(guān)學科進行互補,以獲取進一步的成果。

    參考文獻:

    [1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005.265.

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    [3] HATTORI,KUO K P,SHU Y Z,et al. A triterpene from the fruits of Rubus chingii[J]. Phytochemistry,1988,27(12):3975-3976.

    [4] 郭啟雷,楊峻山.掌葉覆盆子的化學成分研究[J].中國中藥雜志,2005,30(3):198-200.

    [5] 皮慧芳,吳繼洲.覆盆子的化學成分與藥理作用研究述要[J].中醫(yī)藥學刊,2003,21(12):2169,2174.

    [6] 陳坤華,方 軍,宮 斌,等.覆盆子提取成分促進淋巴細胞增殖作用及與環(huán)核苷酸的關(guān)系[J].上海免疫學雜志,1995,15(5):302-304.

    [7] 朱樹森,張炳烈,李文彬,等.覆盆子對衰老模型小鼠腦功能的影響[J].中醫(yī)藥學報,1998(4):42-43.

    [8] 張乃丹.覆盆子多酚提取工藝及不同溶劑提取物抗氧化抑菌活性[D].浙江臨安:浙江農(nóng)林大學,2013.

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