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    水稻OsCER4基因啟動子序列及表達分析

    2015-10-13 23:05:13林曉林等
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年18期
    關(guān)鍵詞:蠟質(zhì)逆境元件

    林曉林等

    摘要:通過生物信息學(xué)方法對水稻(Oryza sativa L.)蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4啟動子序列和表達特性進行了分析;通過構(gòu)建OsCER4啟動子驅(qū)動的GUS融合表達載體,分析了OsCER4基因的時空表達;并分別以200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1.0% H2O2處理水稻幼苗,通過半定量RT-PCR分析逆境脅迫下OsCER4的表達模式。啟動子序列分析表明,OsCER4啟動子中包括大量根、莖、葉肉等特異表達位點以及與干旱、冷、鹽等多種逆境脅迫相關(guān)的調(diào)控序列。表達特征分析表明,OsCER4基因在愈傷組織、根、莖、葉中均有表達,在穎殼和子房中也有表達。NaCl和PEG等逆境脅迫下,OsCER4基因表達量在不同處理時間有所增加,H2O2脅迫下,OsCER4基因表達量有所下降。

    關(guān)鍵詞:水稻(Oryza sativa L.);OsCER4基因;啟動子;表達;逆境

    中圖分類號:Q78 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2015)18-4607-06

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.056

    植物在生長發(fā)育過程中,常常會受到干旱、鹽漬、低溫、病蟲害等非生物和生物脅迫因素的影響,其中,水分脅迫是環(huán)境脅迫中最普遍的逆境因子。干旱脅迫嚴重影響植物生長,增強植物抗旱性已成為植物育種的重要研究方向。在干旱逆境脅迫條件下,植物不僅可以通過細胞內(nèi)的生理生化變化提高對干旱脅迫的耐性,如產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸以及增加抗氧化能力等。同時,植物還可以通過誘導(dǎo)干旱脅迫應(yīng)答基因表達,產(chǎn)生大量特異蛋白,協(xié)同調(diào)節(jié)植物生理生化而適應(yīng)外部逆境,提高對干旱的抗性。因此,剖析相關(guān)基因在植物逆境脅迫應(yīng)答中的作用已成為植物分子生物學(xué)和作物抗旱研究的熱點。

    所有植物的地上部分表皮細胞外都覆蓋著角質(zhì)層,角質(zhì)層由最外層的上表皮蠟質(zhì)層和角質(zhì)膜層組成,其主要功能是防止植物水分損失[1],同時也是抵御外源物質(zhì)滲入和微生物入侵的有效屏障[2]。多個與蠟質(zhì)相關(guān)的基因已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa L.)等植物中被相繼發(fā)現(xiàn)[3-10],烷類合成相關(guān)的蠟質(zhì)基因CER1在干旱脅迫條件下表達量顯著增加[5],而過表達CER1基因提高了植株抗逆性[6]。擬南芥角質(zhì)層蠟質(zhì)和角質(zhì)合成的必需基因LACS1和LACS2發(fā)生突變增加了植株對干旱的敏感性[7];水稻角質(zhì)層蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsGL1-1和OsGL1-2(又命名為WSL2)的突變導(dǎo)致植株葉表面蠟質(zhì)明顯減少,增加了植株干旱敏感性,而過表達OsGL1-1基因提高了植株對干旱的抗性[8-10]。過表達苜蓿中克隆的轉(zhuǎn)錄基因WXP1能增加表皮蠟質(zhì)的積累,減少水分的喪失,增加抗旱能力[11],轉(zhuǎn)WXP1基因的擬南芥耐旱性同樣增加[12]。OsCER4基因與擬南芥CER1基因,水稻OsGL1-1基因和OsGL1-2基因高度同源,屬于脂肪醛脫羧酶(Fatty aldehyde decarbonylase)基因家族成員[13,14]。OsCER4基因(OsGL1-6)主要影響葉表面蠟質(zhì)的合成,OsCER4基因(OsGL1-6)表達量的下降導(dǎo)致葉表面蠟質(zhì)減少,干旱敏感性增加[15]。本研究通過生物信息學(xué)方法對水稻蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4(OsGL1-6)啟動子序列和表達特性進行分析,同時,對逆境脅迫下OsCER4基因(OsGL1-6)的表達模式進行研究,為闡明OsCER4(OsGL1-6)基因在逆境脅迫下的分子作用機制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料 水稻(Oryza sativa L.)品種中花11,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳工程實驗室提供。

    1.1.2 載體與菌株 pCAMBIA1300G,以pCAMBIA1300與pBI221聯(lián)合改建而成,在pCAMBIA1300的多克隆位點上插入了一段CaMV 35S啟動子-GUS-終止子的序列,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳工程實驗室提供;大腸桿菌菌株為DH10B;農(nóng)桿菌菌株為EHA105,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳工程實驗室保存。

    1.1.3 試劑 RNA抽提試劑盒TRIzol 購自 Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄酶(AMV RTase)、RNase inhibitor、Taq DNA聚合酶和dNTP等購自寶生物工程(大連)有限公司;氯仿、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純。

    1.1.4 引物 OsCER4啟動子擴增引物為OsCER4Gpr(5′-AAAAGGATCCTAGAGGCCATGATAGCTAGC-3′)和OsCER4Gpf (5′-AAAAAAG

    CTTGGTTTGGAGATACAATCTGTG-3′);OsActI擴增引物為OsActI-R(5′-TCTGGGTCATCTTCTCACGA-3′)和OsActI-F(5′-CGTCTGCGATAATGGAACTG-3′);OsCER4擴增引物為OsCER4-R(5′-TCGTCGTATGGCCGGAATC-3′)和OsCER4-F(5′-GTCATGCAGTTACAGCAGCA-3′)。

    1.2 方法

    1.2.1 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)對啟動子順式調(diào)控元件進行預(yù)測;應(yīng)用RIFGP(http://plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy)對OsCER4表達的組織器官特異性進行分析。

    1.2.2 OsCER4啟動子表達分析 以O(shè)sCER4Gpf、OsCER4Gpr為引物,以中花11基因組DNA為模板擴增蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4啟動子片段,PCR擴增反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸2 min,共7個循環(huán);94 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,68 ℃延伸2 min,共28個循環(huán);68 ℃延伸10 min。以O(shè)sCER4啟動子片段替代載體pCAMBIA 1 300中的CaMV35S啟動子,重新組裝的載體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入水稻中花11[16]。分別取轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織、根、莖、葉、穗子等材料放于固定液(50 mmol/L磷酸緩沖液、1% 甲醛、0.5% Triton-100、pH 7.0)中,抽真空10 min,固定45 min;棄去固定液,加入適量洗液[50 mmol/L 磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、1 mmol/L K3Fe(CN)6,1 mmol/L K4Fe(CN)6·3H2O、pH 7.0],抽真空5 min,洗3次;棄去洗液,加入染色液[1 mmol/L磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、0.25 mg/mL X-Gluc、1 mmol/L K3Fe(CN)6、1 mmol/L K4Fe(CN)6·3H2O、pH 7.0],抽真空15 min,置于37 ℃反應(yīng)過夜;樣品以70%乙醇進行洗滌和保存,并在解剖鏡下進行觀察拍照。

    1.2.3 逆境處理 參照Li等[17]方法進行,PEG、H2O2和NaCl的濃度分別為12%(M/V),1.0%(V/V),200 mmol/L。

    1.2.4 RT-PCR分析 總RNA抽提參照李玲等[18]方法,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照Cristina等[19]方法。以O(shè)sActI為內(nèi)參基因,以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,以O(shè)sCER4-R、OsCER4-F為引物進行PCR擴增,分析蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4的表達情況。PCR擴增反應(yīng)體系:cDNA 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs(10 mmol/L)0.25 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、ddH2O 19.05 μL。PCR擴增反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,27個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 OsCER4基因啟動子的反式作用元件分析

    應(yīng)用植物啟動子及其反式元件分析在線數(shù)據(jù)庫PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)對OsCER4啟動子順式作用元件進行了預(yù)測,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,OsCER4啟動子存在典型的TATA-box和啟動子的基本元件CAAT-box以及大量的組織特異表達核苷酸位點:29個葉肉特異表達的CACTFTPPCA1位點,22個莖特異表達的位點DOFCOREZM和CCA1ATLHCB1,38個根特異表達位點ROOTMOTIFTAPOX1,RHERPATEXPA7,RYREPEATBNNAPA和RAV1AAT;4個花器發(fā)育相關(guān)元件MYBPLANT和NTBBF1ARROLB。OsCER4啟動子也包括大量的與逆境相關(guān)的順式作用元件:早期應(yīng)答脫水脅迫和ABA應(yīng)答有關(guān)的順式作用元件ACGTABREMOTIFA2OSEM、ABRELATERD1、

    ACGTATERD1、ANAERO1CONSENSUS、MYB1AT、MYBCORE、DPBFCOREDCDC3、CATATGGMSAUR、GADOWNAT、MYB1AT、MYCATRD22、MYCATERD1和WRKY71OS以及響應(yīng)高鹽、冷、傷害、病原菌等生物和非生物脅迫的順式元件GT1GMSCAM4、MYCCONSENSUSAT、BIHD1OS、MYBPZM、RAV1AA

    T、OSE2ROOTNODULE、WBBOXPCWRKY1、MYBST

    1、ELRECOREPCRP1和WBOXNTERF3等;還有響應(yīng)Ca2+信號、氧化脅迫以及銅離子脅迫相關(guān)的順式作用元件CURECORECR和ABRERATCAL。同時,還存在外源激素信號分子生長素、細胞分裂素、水楊酸相關(guān)順式作用元件SURECOREATSULTR11、ARR1AT、CPBCSPOR、WBOXATNPR1和ASF1MOT

    IFCAMV等。除了脅迫相關(guān)順式作用元件,還發(fā)現(xiàn)與儲藏蛋白質(zhì)表達相關(guān)的調(diào)控元件2SSEEDPROTBANAPA和SEF4MOTIFGM7S;光誘導(dǎo)順式作用元件GATABOX、REALPHALGLHCB21和IBOXCORE/SORLIP1AT以及糖應(yīng)答元件CGACGOSAMY3、WBOXHVISO1、YRIMIDINEBOXOSRAMY1A、TATC

    CAYMOTIFOSRAMY3D和MYBGAHV等。通過啟動子順式元件網(wǎng)站的分析預(yù)測,水稻蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4啟動子具有葉、根、莖等組織特異表達的特性,且存在多個響應(yīng)生物和非生物逆境脅迫的元件。

    2.2 OsCER4基因的表達分析

    通過水稻基因組芯片表達數(shù)據(jù)庫(http://plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy)分析表明,OsCER4基因主要在幼苗葉、幼苗、子房和胚中表達,OsCER4基因可能在葉或種子發(fā)育中起作用(表2)。

    2.3 OsCER4啟動子的表達分析

    從中花11基因組中用引物OsCER4Gpr和OsCER4Gpf擴增OsCER4基因的啟動子OsCER4P。結(jié)果表明,獲得與預(yù)期大小一致的1 946 bp特異片段(圖1a)。用Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切將OsCER4P啟動子片段克隆到pCAMBIA1300G載體中,用OsCER4基因的啟動子CER4P替代載體中的35S啟動子,然后抽提質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定,結(jié)果如圖1b所示。將質(zhì)粒DNA酶切鑒定的菌液送至Invitrogen公司測序,測序正確的菌株抽取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。同時,本研究通過對農(nóng)桿菌的GUS染色來鑒定啟動子啟動GUS活性表達的能力以及進一步確認農(nóng)桿菌的陽性克隆。結(jié)果(圖1c)表明,啟動子具有啟動GUS活性表達的能力。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsCER4P::GUS載體轉(zhuǎn)化水稻,轉(zhuǎn)化植株經(jīng)陽性植株鑒定之后,取其愈傷組織、根、莖、葉及小穗進行GUS染色,通過GUS組織化學(xué)染色方法來分析OsCER4基因啟動子表達的特異性。GUS染色分析表明,在愈傷組織、根、莖、葉中均能檢測到GUS活性(圖2)。在穎殼和子房中也有GUS活性表達,說明OsCER4的表達有組織特異性,可能與營養(yǎng)器官和種子的發(fā)育有關(guān)。

    2.4 逆境脅迫下OsCER4的表達分析

    為考察水稻蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4對逆境的響應(yīng),本研究采用半定量RT-PCR的方法分析不同逆境處理下幼苗中OsCER4表達變化。結(jié)果(圖3)表明,NaCl處理下對OsCER4而言,在處理6 h之內(nèi),其表達量下降,當處理時間達12 h時,表達量有所增加;PEG處理下,OsCER4表達量在處理30 min 后開始有所增加,并維持在較高水平,36 h時略有下降;H2O2處理下,OsCER4表達量在處理30 min 時變化不明顯,3 h時表達量開始下降。

    3 小結(jié)與討論

    植物基因啟動子控制著基因在特定的組織、特定的發(fā)育階段以及一定的環(huán)境條件下表達。基因所表現(xiàn)的時空特異性受到該基因啟動子區(qū)域內(nèi)各種順式作用元件與不同反式作用因子之間相互作用的協(xié)調(diào)控制。啟動子序列分析表明,OsCER4基因啟動子具有啟動子常有的相應(yīng)調(diào)控元件以及下游組織特異性表達必需的核苷酸序列,包括TATA-box、CAAT-box等。啟動子還含有大量的組織特異表達順式作用元件:葉肉、莖、根、花器發(fā)育(MYBPLANT)以及微管組織發(fā)育(NTBBF1ARROLB)相關(guān)的特異順式表達元件,說明OsCER4基因可能與營養(yǎng)器官和微管組織以及種子的發(fā)育有關(guān)。通過水稻基因組芯片表達數(shù)據(jù)庫分析表明,OsCER4基因在幼苗、幼葉、子房和胚中表達量較高。而OsCER4啟動子驅(qū)動的GUS融合表達分析表明,OsCER4基因啟動子在根、莖、葉、葉枕、穎殼、子房等均有表達活性,在花藥中幾乎沒有表達活性,進一步說明OsCER4基因可能與營養(yǎng)器官和種子的發(fā)育有關(guān)。在對OsCER4基因(OsGL1-6)的前期研究中發(fā)現(xiàn),OsCER4基因表達部位集中于維管束區(qū)域[15],這一結(jié)果與本研究對啟動子區(qū)域的組織特異表達順式作用元件分析一致。說明OsCER4基因啟動子序列上一系列的順式元件決定了其組織器官的表達。

    植物組織特異表達的啟動子中存在著不同的結(jié)構(gòu)域,通過這些結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用調(diào)節(jié)著啟動子不同的表達模式。OsCER4基因啟動子序列中還有大量干旱、高鹽、病原菌、冷等逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)順式作用元件,說明OsCER4基因啟動子調(diào)控的下游基因與植物逆境應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)研究該基因在PEG、高鹽和H2O2等處理下的表達模式,結(jié)果表明,在高鹽和干旱處理條件下,OsCER4基因表達量均有所上調(diào)。植物表皮蠟質(zhì)層在植物生長發(fā)育、適應(yīng)外界環(huán)境方面具有重要作用,植物表皮蠟質(zhì)層的增加常常受環(huán)境逆境的誘導(dǎo)。玉米、擬南芥等植物蠟質(zhì)合成中的關(guān)鍵基因在mRNA水平上的表達受干旱、鹽逆境處理調(diào)節(jié)[20]。擬南芥在150 mmol/L NaCl處理下葉蠟質(zhì)總量增加[5]。水稻幼苗在NaCl、H2O2、ABA等逆境脅迫下,OsGL1-5基因表達均受到誘導(dǎo)[20]。逆境處理誘導(dǎo)蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的表達以及增加蠟質(zhì)的積累可能是植物適應(yīng)環(huán)境的一種機制。蠟質(zhì)合成相關(guān)基因在不同逆境處理下誘導(dǎo)表達的情況不一樣,本試驗發(fā)現(xiàn)H2O2處理下,OsCER4基因表達量下降,而在分析OsGL1-5基因的逆境響應(yīng)時發(fā)現(xiàn)其在H2O2處理下的表達量增加[21]。高國賦等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)不同蠟質(zhì)合成相關(guān)基因?qū)Σ煌{迫響應(yīng)存在差異,前期研究高溫和低溫對蠟質(zhì)基因表達的影響時也有同樣發(fā)現(xiàn)[16]。

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