刺托竹蓀菌蓋碳量子點(diǎn)的制備及其抑菌性研究

鄭梅霞 林麗萍 劉波 陳崢 朱育菁

摘 要：【目的】利用廢舊生物質(zhì)資源制備量子點(diǎn)并增加細(xì)菌病害防治的資源?！痉椒ā恳源掏兄裆p菌蓋采用水熱法合成碳量子點(diǎn)，并用透射電鏡掃描、紅外光譜、XRD和熒光分析對(duì)碳量子點(diǎn)進(jìn)行表征。選取青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum和地毯草黃單胞菌Xanthomonas axonopodis作為供試菌種，采用抑菌圈法對(duì)碳量子點(diǎn)的抑菌性能進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】該方法制得的碳量子點(diǎn)近似球形，粒徑均勻，分散性好。其發(fā)射波長(zhǎng)依賴于激發(fā)波長(zhǎng)，在紫外燈的照射下，出現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光。碳量子點(diǎn)對(duì)青枯雷爾氏菌和地毯草黃單胞菌均有明顯的抑菌作用?！窘Y(jié)論】獲得了一種可用于防治植物細(xì)菌病害的量子點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：碳量子點(diǎn);水熱;抑菌;竹蓀

中圖分類號(hào)：TS 201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）04-438-05

Abstract： 【Objective】 Utilization of mushroom biomass waste to prepare carbon dots （CDs） for the prevention and control of diseases on plants was studied. 【Method】 CDs were obtained by hydrothermal oxidation of pilei of Dictyophora echinovolvata and characterized by the transmission electron microscopy （TEM）， Fourier transform infrared spectrophoto-metry （FT-IR）， x-ray diffraction （XRD）， and fluorescene spectrophotometry. Antibacterial properties of the CDs were determined by measurements of diameter of the bacteriostatic circle on Ralstonia solanacearum and Xanthomonas axonopodis. 【Result】 The CDs obtained displayed an appropriate spherical morphology and uniform size with good dispersion. They emitted bright blue photoluminescence under UV excitation， exhibited an excitation-dependent PL behavior， and demonstrated excellent antibacterial activities against R. solanacearum and X. axonopodis. 【Conclusion】 The CDs with a potential of preventing and controlling plant diseases by bacterial infection were successful prepared in laboratory.

Key words： Carbon dots; hydrothermal method; antibacterial activity; Dictyophora echinovolvata

0 引言

【研究意義】碳量子點(diǎn)（Carbon dots， CDs）由碳元素構(gòu)成，作為熒光性能優(yōu)異的納米材料（<10 nm），具有良好的熒光性能、良好的生物相容性、低生物毒性等優(yōu)點(diǎn)[1]。其制備方法有很多種，通?？煞譃樽陨隙路ê妥韵露戏?，自上而下法是將碳骨架徹底粉碎而生成CDs的方法，包括弧光放電法、電化學(xué)法和激光銷蝕法等;自下而上法是以一些有機(jī)分子作為前驅(qū)體碳源來(lái)合成CDs，包括模板法、微波消解合成法、超聲振蕩法、溶劑熱法、強(qiáng)酸氧化法以及水熱法等，其中水熱法合成過(guò)程比較簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)且綠色環(huán)保[2]。生物質(zhì)材料作為可再生無(wú)污染資源，作為制備碳量子點(diǎn)的碳源具有較大的優(yōu)勢(shì)。劉辰等[3]利用玉米秸稈制備酒精的殘余物酶解木質(zhì)素制備碳量子點(diǎn);陳文新等[4]利用甘蔗渣為原料制備碳量子點(diǎn)。竹蓀可分成可食部分（菌柄和菌裙）和不可食部分（菌蓋和菌托）。商品竹蓀只是采收、加工可食部分，而占子實(shí)體鮮重60%以上的菌蓋和菌托被直接遺棄，造成巨大的資源浪費(fèi)[5]。如能選用竹蓀的副產(chǎn)物竹蓀菌蓋制備量子點(diǎn)，則可增大資源利用率?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】碳量子點(diǎn)具有抑菌效果，Dou等[6]利用葡萄糖和聚乙烯亞胺制備的多功能碳量子點(diǎn)可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌;李紅霞等[7]制備的槲皮素復(fù)合物碳量子點(diǎn)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌也具有明顯的抑制作用;Liu等[8]利用甲硝唑合成的碳量子點(diǎn)可以抑制牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】迄今尚未見(jiàn)碳量子點(diǎn)用于抑制植物病害致病菌的研究。作物的細(xì)菌性病害是一類世界范圍的嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)的病害[9]。青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum會(huì)引起番茄[10]、茄子[11]、花生[12]、煙草[13]等44個(gè)科的數(shù)百種植物發(fā)生青枯病[14];地毯草黃單胞菌Xanthomonas axonopodis會(huì)引起柑橘潰瘍病[15]、木薯枯萎病[16]和棉豆的白葉枯病[17]等，細(xì)菌病害給作物生產(chǎn)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。盡管對(duì)它們的防治有很多研究報(bào)道，如篩選生防菌、栽培措施、作物輪作及品種抗性選擇等，但未出現(xiàn)有效的防治措施[18]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用刺托竹蓀生產(chǎn)的副產(chǎn)物竹蓀菌蓋為前軀體，采用水熱法制備碳量子點(diǎn)，選取青枯雷爾氏菌和地毯草黃單胞菌為植物細(xì)菌性病害病原菌種，采用抑菌圈法對(duì)制得的量子點(diǎn)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。為豐富細(xì)菌病害防治的資源奠定基礎(chǔ)，并為廢舊生物質(zhì)資源利用提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棘托竹蓀Dictyophora echinovolvata菌球由福建省順昌縣食用菌辦提供。竹蓀菌球洗凈后放置試驗(yàn)臺(tái)上，待其完全開傘后收集竹蓀菌蓋，清洗掉菌蓋上的孢體，室溫下晾干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試菌株與培養(yǎng)基

青枯雷爾氏菌FJAT-91、地毯草黃單胞菌FJAT-10151，-80℃甘油冷凍保存，現(xiàn)保藏在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所。

培養(yǎng)基：NA液體培養(yǎng)基（牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1）;NA固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入18 g·L-1瓊脂，半固體培養(yǎng)基則加入9 g·L-1瓊脂。

1.3 碳量子點(diǎn)的制備

稱取1 g的竹蓀菌蓋，用15 mL超純水分散均勻，將樣品裝入25 mL的聚氟乙烯反應(yīng)釜中，180℃水熱反應(yīng)8 h，自然冷卻，用0.22 μm的尼龍過(guò)濾頭過(guò)濾，用1 000 Da透析20 h，每隔8 h換一次水。透析袋內(nèi)溶液即為碳量子點(diǎn)CDs溶液。

1.4 抑菌試驗(yàn)

病原菌發(fā)酵液的獲得：-80℃冰箱取菌株FJAT-91、FJAT-10151凍存管，待其回溫到室溫，于超凈臺(tái)內(nèi)劃線于NA固體培養(yǎng)基上，倒置于生物培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)2 d后，挑取單菌落進(jìn)行第二次劃線培養(yǎng)，保證活化菌落形態(tài)單一。挑取第二次活化后的單菌落于各含100 mL NA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于30℃、170 r·min-1搖床中培養(yǎng)培養(yǎng)2 d，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)病原菌發(fā)酵液在600 nm的吸光度值，備用。

分別取1 mL病原菌FJAT-91（OD600 = 1.928）和FJAT-10151（OD600 = 1.152）的發(fā)酵液與200 mL 50℃的NA半固體培養(yǎng)基混合后，倒入已制備好的NA固體培養(yǎng)基中，制成含病原菌的雙層培養(yǎng)基;待培養(yǎng)基凝固后，用直徑9 mm的打孔器在平板上打孔，在孔內(nèi)分別加入200 μL碳量子點(diǎn)樣品CDs，以水為對(duì)照，30℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察抑菌效果。

1.5 結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 透射電鏡掃描

采用HITACHI HT7700對(duì)碳量子點(diǎn)的形貌進(jìn)行分析，用3%戊二醛固定樣品后，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后制作銅網(wǎng)底片，再用1%的磷鎢酸染色，干燥后采用透射電子顯微鏡觀察，電壓為80 kV。

1.5.2 紅外光譜分析

采用德國(guó)布魯克公司傅立葉紅外光譜儀，利用溴化鉀壓片法對(duì)所制備的量子點(diǎn)在波長(zhǎng)范圍500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。

1.6 熒光分光光度分析

采用Horiba公司的Fluoromax-4 熒光光譜儀進(jìn)行熒光測(cè)定，狹縫為2 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳量子點(diǎn)的表征

2.1.1 透射電鏡掃描分析

碳量子點(diǎn)CDs的透射電鏡圖如圖1所示，碳量子點(diǎn)CDs的粒度分布窄，單分散性好，平均直徑為2 nm，為非結(jié)晶性物質(zhì)。

2.1.2 紅外光譜分析

碳量子點(diǎn)的紅外光譜分析如圖2所示。3 439 cm-1處的吸收峰為-OH伸縮振動(dòng)，3 205 cm-1處的吸收峰為-NH2伸縮振動(dòng)，1 648 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)，1 397、1 121、1 048 cm-1處的吸收峰為C-O-C伸縮振動(dòng)，說(shuō)明碳量子點(diǎn)表面富含大量的羧基和羥基，表明碳量子點(diǎn)具有很強(qiáng)的親水性。這些基團(tuán)對(duì)CDs-C的改性和應(yīng)用起到重要的作用，大量的羧基和羥基使其具有極強(qiáng)的溶解性，凍干后極易吸潮。

2.1.3 熒光分析

圖3-A左圖是碳量子點(diǎn)在365 nm紫外燈照射下的藍(lán)色熒光，可以看出，碳量子點(diǎn)具有熒光性。其最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為396 nm/470 nm，在396 nm光的激發(fā)下可發(fā)射出470 nm的熒光（圖3-B）;其發(fā)射具有明顯的波長(zhǎng)依賴性（圖3-C），CDs隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增大，其熒光發(fā)射峰從440 nm紅移至505 nm，發(fā)射峰強(qiáng)度先增大后減小。

2.2 碳量子點(diǎn)對(duì)植物病原菌的抑制效果

竹蓀菌蓋制備的碳量子點(diǎn)CDs對(duì)植物病原菌青枯雷爾氏菌FJAT-91和地毯草黃單胞菌FJAT-10151均具有抑制效果，如圖4所示。抑菌圈直徑如表1所示，其對(duì)菌株FJAT-91的抑菌圈直徑大小為（25.21±1.73）mm，對(duì)菌株FJAT-10151的抑菌圈直徑大小為（22.41±1.05）mm。

3 討論與結(jié)論

本研究以刺托竹蓀菌蓋為碳源，采用一種工藝簡(jiǎn)單、制備成本低、綠色環(huán)保的水熱法制備了平均直徑為2 nm的熒光碳量子點(diǎn)，并借助紅外光譜法、透射電鏡和熒光光譜法等表征手段研究碳量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，同時(shí)，該碳量子點(diǎn)對(duì)青枯雷爾氏菌和地毯草黃單胞菌具有較好的抑制作用，為細(xì)菌病害防治奠定基礎(chǔ)。

竹蓀菌蓋含有氨基酸[19]、蛋白質(zhì)[20]、多糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖等）[21]和揮發(fā)油（芳香烴、醇、脂肪酸、酮、倍半萜、酯、醛等）[22]等，是一種制備量子點(diǎn)的資源，本研究利用竹蓀菌蓋制備獲得了碳量子點(diǎn)。

防治青枯雷爾氏菌和地毯草黃單胞菌的主要措施有化學(xué)農(nóng)藥防治[23]、殺菌劑[24]、芽胞桿菌[25]和輪作[26]等，但是防治效果不理想。本研究制備的量子點(diǎn)能有效抑制青枯雷爾氏菌和地毯草黃單胞菌，是一種新的防治資源。

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（責(zé)任編輯：林海清）