大豆皂甙對(duì)高鹽飲食小鼠血壓和腸道菌群的影響

張光遠(yuǎn) 吳曉利 張志明 何冬旭

摘?要：目的：探究大豆皂甙通過(guò)影響腸道菌群對(duì)高鹽引起的小鼠高血壓的調(diào)控，并篩選起到穩(wěn)定血壓作用的目標(biāo)腸道菌群，為新的功能食品和益生菌的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法：15只健康成年雄性小鼠被隨機(jī)分成3組：（1）喂食含0.5%NaCl的飼料（正常飲食，NSD組）;（2）喂食含8%NaCl的飼料（高鹽飲食，HSD組）;（3）喂食含8%NaCl的飼料，高鹽飲食9w后，飲食中添加大豆皂甙Bb，持續(xù)3w（高鹽飲食+大豆皂甙，HSD_SI組）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，分別收集3組小鼠新鮮糞便，提取糞便總DNA，并對(duì)16s rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，微生物多樣性分析和差異OTU比對(duì)。結(jié)果：大豆皂甙可以顯著降低由高鹽飲食誘導(dǎo)的小鼠血壓升高。同時(shí)減少部分在高鹽飲食過(guò)程中顯著增加的OTU的豐度，這部分OTU中可能包含使機(jī)體血壓升高的有害菌;另外使部分在高鹽飲食過(guò)程中減少的OTU的豐度得到恢復(fù)和增加，這部分OTU中可能存在潛在的可以降低機(jī)體血壓的益生菌。推論：大豆皂甙可能通過(guò)影響腸道菌群而調(diào)控血壓。

關(guān)鍵詞：大豆皂甙;高血壓;腸道菌群

高鹽飲食誘導(dǎo)血壓升高的機(jī)制研究主要集中在腎臟和交感神經(jīng)系統(tǒng)[1-4]，不過(guò)，Wilck等[5]的發(fā)現(xiàn)使研究者們的注意力轉(zhuǎn)移到機(jī)體自身腸道菌群對(duì)血壓的影響上。大豆皂甙是大豆膳食中重要的功能性成分，是齊墩果烷型三萜糖苷類，存在于大豆和其他一些豆科植物中[6]。離體和在體實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)大豆皂甙對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，如通過(guò)抗氧化、降低血漿膽固醇等功能可能對(duì)機(jī)體血壓產(chǎn)生影響[7-8]。Takahashi等[9]在自發(fā)性高血壓大鼠模型中發(fā)現(xiàn)口服大豆皂甙Bb可以顯著降低血管收縮壓，離體實(shí)驗(yàn)中大豆皂甙Bb可以作為腎素的抑制劑，通過(guò)腎素-血管緊張素系統(tǒng)降低血壓。但是，Kamo等[10]在對(duì)大豆皂甙的生物利用率的研究中顯示，大豆皂甙被吸收進(jìn)入血液循環(huán)的量低于離體實(shí)驗(yàn)中的有效作用濃度。由此，筆者認(rèn)為大豆皂甙對(duì)機(jī)體的直接作用并不能完全解釋其對(duì)心血管系統(tǒng)的影響。鑒于大豆皂甙首先需要經(jīng)過(guò)腸道微生物群落的代謝才能被機(jī)體吸收，且大豆皂甙可抑制某些特定菌群的生長(zhǎng)[11]，我們推測(cè)大豆皂甙也可以通過(guò)改變結(jié)腸中微生物群落組成的方式參與機(jī)體血壓的調(diào)節(jié)。

本研究構(gòu)建了與人類鹽敏感性高血壓相似的高鹽飲食誘導(dǎo)的小鼠高血壓模型[12]，然后通過(guò)飲食中添加大豆皂甙，觀察和記錄小鼠血壓的變化，并對(duì)小鼠糞便樣品進(jìn)行16s rDNA擴(kuò)增子測(cè)序，分析高鹽攝入和大豆皂甙對(duì)小鼠結(jié)腸中微生物群落的影響。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?C57BL/6J雄性小鼠，8w齡，SPF（Specific Pathogen Free）級(jí)，購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。

1.1.2?主要試劑?正常小鼠飼料（NSD，Normal Salt Diet，0.5% NaCl）和高鹽小鼠飼料（HSD，High Salt Diet，8% NaCl），南京特洛菲飼料科技有限公司;大豆皂甙Bb（Soyasaponin I），CAS 51330-27-9，純度：HPLC，≥98%，上海源葉生物科技有限公司;糞便基因組DNA提取試劑盒（DP328-02），天根生物科技有限公司;Qubit dsDNA Assay Kit（Q328520），Life Technologies;HiFi Hot Start Ready Mix（KK2501），Kapa。

1.1.3?主要儀器?小鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試設(shè)備（4通道），美國(guó)IITC公司;臺(tái)式高速離心機(jī)（Centrifuge 5418），Eppendorf;PCR 儀（580BR10905），Bio-rad;電泳儀（HE-120），Tanon;凝膠成像儀（2500），Tanon;Bioanalyzer（2100），Aglient;MiSeq基因測(cè)序儀，Illumina公司。

1.2?方法

1.2.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理?所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都嚴(yán)格按照國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施辦法》相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，并得到江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的允許。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在12h光照（白天）和12h黑暗（夜間）循環(huán)，溫度控制在20～24℃，濕度40%～60%的屏障環(huán)境中，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)使用8w齡，C57BL/6J，雄性小鼠，體重22～25g，共15只。進(jìn)入屏障環(huán)境后，正常飼料預(yù)飼養(yǎng)1w。之后隨機(jī)平均分為3組：正常飲食組（NSD，n=5）;高鹽飲食組（HSD，n=5）;高鹽飲食+大豆皂甙組（HSD_SI，n=5）。處理：NSD組喂食正常飼料，HSD組和HSD_SI組喂食高鹽飼料，持續(xù)9w，第10周開(kāi)始對(duì)HSD_SI組小鼠灌胃大豆皂甙Bb[1.51mg/（kg·d）]，灌胃體積為100μL/10 g，溶劑為1%吐溫80]，NSD組和HSD組灌胃等體積溶劑，持續(xù)3w。同時(shí)記錄攝食、飲水、體重和血壓變化。

1.2.2?劑量設(shè)計(jì)?大豆皂甙在大豆中的含量在0.1%～0.5%之間，取最低值，若成人每日攝入大豆類膳食10g，則攝入大豆皂甙的量為10mg，以成人體重為60kg，根據(jù)體表面積將人體劑量換算為小鼠劑量[13]為1.51mg/（kg·d）。

1.2.3?糞便樣品收集?灌胃3w后，分別收集3組小鼠新鮮糞便，通過(guò)壓迫腹腔的方法，在肛門口直接收集，每組3只（n=3），樣品置于干凈無(wú)菌EP管中，立即放在冰上，隨后放入-80℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)分析。

1.2.4?基因組DNA的提取和高通量測(cè)序樣品的準(zhǔn)備?使用糞便DNA抽提試劑盒對(duì)小鼠糞便樣品基因組DNA進(jìn)行提取，增加添加蛋白酶K（終濃度5mg/mL）65℃孵育10min和95℃孵育10min的步驟，以使革蘭氏陽(yáng)性菌更充分裂解。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 的純度和濃度，之后無(wú)菌水稀釋樣品至1ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，選擇測(cè)序區(qū)域?yàn)榧?xì)菌16S rDNA的V3-V4 區(qū)，使用帶 Barcode 的特異引物（343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′），KAPA公司的HiFi Hot Start Ready Mix高保真酶，進(jìn)行 PCR，以確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行 Qubit 定量。根據(jù) PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，隨后上機(jī)測(cè)序。

1.2.5?原始測(cè)序數(shù)據(jù)處理?原始雙端測(cè)序數(shù)據(jù)使用Trimmomatic[14]軟件進(jìn)行去雜，之后使用FLASH（v1.2.11）[15]軟件拼接，拼接后的數(shù)據(jù)使用QIIME（version 8.0）[16]軟件，根據(jù)barcode序列區(qū)分各個(gè)樣品的序列數(shù)據(jù)，生成不含barcode的各樣品序列文件，之后序列進(jìn)行進(jìn)一步去雜，去除低質(zhì)量的堿基序列以及模糊堿基序列，最后采用usearch[17]軟件去除嵌合體序列，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本中所含的最終序列數(shù)。

1.2.6?生物信息分析?最終得的序列使用Uparse[18]軟件以97% 相似度進(jìn)行可操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）[19]劃分。從各OTU中挑選豐度最大的序列作為代表序列與Silva 數(shù)據(jù)[20]進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)注釋采用RDP classifier Naive Bayesian[21]分類算法。之后對(duì)各樣品中OTU進(jìn)行多樣性分析和群落結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)單因素方差分析分別對(duì)小鼠糞便微生物物種豐度在NSD組、HSD組和HSD_SI組間的差異進(jìn)行顯著性分析和比對(duì)，篩選出同時(shí)受高鹽攝入和大豆皂甙反向調(diào)節(jié)的OTU。

2?結(jié)果與分析

2.1?動(dòng)物模型構(gòu)建和血壓變化

如圖1所示，將正常飼料換為高鹽飼料后，相比于NSD組小鼠，HSD組小鼠的收縮壓和舒張壓都顯示出上升趨勢(shì)，并在第8周之后收縮壓大于120mm Hg和舒張壓大于90mm Hg，隨后保持相對(duì)穩(wěn)定，并且與NSD組小鼠收縮壓和舒張壓顯示出顯著差異，表明高鹽攝入使高鹽飲食小鼠血壓顯著升高;在第10周開(kāi)始對(duì)HSD_SI組小鼠灌胃大豆皂甙，1.5mg/（kg·d），持續(xù)3w，該組小鼠的收縮壓和舒張壓同時(shí)顯現(xiàn)出下降趨勢(shì)，表明大豆皂甙可以緩解由高鹽攝入誘導(dǎo)的小鼠血壓升高。

同時(shí)通過(guò)3組小鼠攝食量、飲水量和體重的對(duì)比（圖2），發(fā)現(xiàn)不同組別在攝食量和體重上沒(méi)有出現(xiàn)明顯的差異，只有飲水量在正常飲食和高鹽飲食間出現(xiàn)明顯改變，這與飼料成分除NaCl含量不同以外其他成分相同相一致。同時(shí)也說(shuō)明我們的實(shí)驗(yàn)中所用大豆皂甙的灌胃劑量不會(huì)對(duì)小鼠的胃腸道產(chǎn)生明顯的刺激作用，排除了可能單獨(dú)由灌胃引起的炎癥和體重改變對(duì)小鼠血壓產(chǎn)生的影響。

2.2?3組小鼠糞便中菌群組成比對(duì)

對(duì)3組小鼠糞便中微生物進(jìn)行了擴(kuò)增子測(cè)序，OTU聚類和注釋，基于OTU分類，繪制了3組小鼠糞便中菌群組成的柱狀圖，顯示3組小鼠結(jié)腸中菌群組成具有一定差異（圖3）。

Chao指數(shù)反映各樣品的α多樣性，是通過(guò)實(shí)際觀察到的OTU數(shù)目和群落中只檢測(cè)到1次和2次的OTU 數(shù)目計(jì)算，估計(jì)樣品中實(shí)際存在的OTU數(shù)目，如圖4所示，NSD組和HSD組樣品間沒(méi)有顯著差異，表明相比于NSD組高鹽攝入并沒(méi)有使HSD組小鼠結(jié)腸微生物的α多樣性發(fā)生顯著改變，同樣HSD組和HSD_SI組間也沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明飲食中大豆皂甙Bb的添加沒(méi)有使小鼠結(jié)腸內(nèi)菌群的α多樣性發(fā)生顯著改變。

PCA分析顯示，3組樣品間OTU的組成改變，差異反映在二維坐標(biāo)軸上為距離遠(yuǎn)近。圖5中HSD組樣品和NSD組樣品間在二維坐標(biāo)軸上顯示出不同分布，說(shuō)明相比于NSD組高鹽攝入改變了HSD組小鼠結(jié)腸中菌群OTU的組成，高鹽攝入對(duì)結(jié)腸中微生物群落組成具有一定的影響;而HSD_SI組樣品在坐標(biāo)系里的分布介于HSD組和NSD組之間，表明大豆皂甙同樣作用于腸道菌群，緩解了高鹽攝入造成的部分腸道菌群組成的改變。

2.3?高鹽飲食和大豆皂甙反向調(diào)節(jié)的OTU

分別通過(guò)單因素方差分析對(duì)在高鹽攝入后豐度改變的OTU和在飲食中補(bǔ)充大豆皂甙Bb后豐度發(fā)生改變的OTU，進(jìn)行了差異顯著性分析。通過(guò)HSD組和NSD組間的比較，HSD組相比于NSD組有33個(gè)OTU的豐度發(fā)生了顯著改變（P<0.05）;通過(guò)HSD_SI組和HSD組間比較，發(fā)現(xiàn)22個(gè)OTU的變化具有顯著性（P<0.05）。對(duì)兩次的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其中11個(gè)OTU在兩次方差分析中都發(fā)生了顯著改變，并且受到高鹽攝入和飲食中大豆皂甙Bb添加的反向調(diào)節(jié)。8個(gè)OTU在HSD組豐度顯著高于NSD組和HSD_SI組，分別屬于Anaerotruncus（厭氧棍狀菌屬）、Christensenellaceae（克里斯滕森菌科）、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Alistipes（另枝菌屬）、Anaerotruncus（厭氧棍狀菌屬）、Ruminiclostridium_9（瘤胃梭菌屬_9）和Streptococcus saliva（唾液鏈球菌）;3個(gè)OTU在HSD組豐度顯著低于NSD組和HSD_SI組，分別屬于Bacteroidales_S24-7 group（擬桿菌S24-7科）和Desulfovibrio（脫硫弧菌屬）（圖6）。

3?結(jié)論

大豆皂甙Bb可以顯著緩解由高鹽飲食造成的小鼠血壓升高，同時(shí)使部分在高鹽飲食后豐度升高的腸道菌的豐度降低，也會(huì)使部分在高鹽飲食過(guò)程中降低的腸道菌群的豐度得到一定程度的恢復(fù)和升高，這些腸道菌群與血壓的變化具有一定程度的相關(guān)性，可能參與機(jī)體血壓的調(diào)節(jié)過(guò)程，可以被認(rèn)為是潛在的對(duì)機(jī)體血壓有影響的有害菌或益生菌。

4?討論

膳食成分和腸道菌群與心血管疾病的關(guān)系越來(lái)越受到人們的關(guān)注，大豆皂甙作為大豆膳食中的重要功能性成分對(duì)鹽敏感性高血壓具有顯著的調(diào)節(jié)作用，它的代謝和吸收也需要腸道菌群的充分參與并同時(shí)對(duì)腸道菌群的組成和功能產(chǎn)生影響。小鼠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓模型與人的鹽敏感性高血壓相似，所以本實(shí)驗(yàn)采用長(zhǎng)期高鹽攝入構(gòu)建了小鼠高血壓模型，并在小鼠高鹽高血壓模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)大豆皂甙灌胃證實(shí)了大豆皂甙對(duì)高鹽高血壓的調(diào)節(jié)作用。另外，還通過(guò)擴(kuò)增子分析篩選了11個(gè)受到高鹽攝入和大豆皂甙反向調(diào)節(jié)的OTU，但是它們的豐度改變對(duì)機(jī)體血壓是否具有調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究。

本研究旨在更深入地了解高鹽飲食和膳食成分在高血壓發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用，對(duì)《中國(guó)防治慢性病中長(zhǎng)期規(guī)劃（2017—2025年）》中提出的降低我國(guó)居民高血壓等心血管相關(guān)疾病的發(fā)病率提供科學(xué)依據(jù)?！?/p>

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Effect of Soyasaponin on Blood Pressure and Intestinal Bacteria in High-salt-diet Mice

ZHANG Guang-yuan?1，WU Xiao-li?1，ZHANG Zhi-ming?1，HE Dong-xu?2

（?1School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;?2 National Engineering Research Center for Functional Food，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of soyasaponin on blood pressure and intestinal bacteria in high-salt-diet mice，and to screen the target intestinal bacteria that stabilizes blood pressure，providing scientific basis for the development of new functional foods and probiotics.MethodHealthy adult male mice（n=15）were randomly assigned into 3 groups including fed with diet containing 0.5% NaCl（NSD），fed with diet containing 8% NaCl（HSD group），fed with high-salt diet for 9 weeks，gavaged with soyasaponin Bb for another 3 weeks and remain in high-salt diet（HSD_SI group）.Fresh feces from 3 groups of mice were collected aseptically，and intestinal microbiota was detected by Illumina high-throughput sequencing.Microbial diversity analysis and differential OTUs comparison were performed.ResultSoyasaponin could significantly reduce the increase in blood pressure in high-salt-diet mice.At the same time，it reduced the abundance of several OTUs that were significantly increased during the high-salt diet.These OTUs might contain harmful bacteria that raise the bodys blood pressure.In addition，it also increased the abundance of several other OTUs that reduced during the high-salt diet，these OTUs might contain potential probiotics that could lower the bodys blood pressure.ConclusionSoyasaponin may regulate blood pressure via interact with intestinal bacteria.

Keywords：soyasaponin;hypertension;intestinal bacteria

（責(zé)任編輯?李婷婷）