甘草多糖的提取及其抗氧化活性研究

烏蘭其其格 宋學軍 段雪琴

摘要：本文利用水提醇沉法從甘草中提取甘草粗多糖，用沉淀法對提取的甘草粗多糖進行分離純化后，得到三種多糖，即水提一級、二級、三級多糖，并對粗多糖和三種分級多糖進行了光譜性能分析.紫外光譜結(jié)果顯示，四種多糖在260-280nm處均有吸收，表明含有蛋白質(zhì)或核酸;紅外光譜結(jié)果表明，四種多糖都具有多糖的特征吸收峰.另外，根據(jù)芬頓反的原理研究了所制備的甘草多糖清除羥自由基的能力，并研究了甘草多糖對醬油中羥基自由基清除能力的影響，結(jié)果表明，加入甘草多糖的醬油試樣對羥基的清除能力有明顯的增強.

關鍵詞：甘草多糖;提取;分級;抗氧化性

中圖分類號：S567.2;O657? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2019）06-0036-03

1 前言

甘草別名還有烏拉爾甘草，國老，甜根，甜草，屬豆科，是著名的傳統(tǒng)藥用植物[1]，主要生長在內(nèi)蒙古，新疆，寧夏等地.隨著科學的發(fā)展，在1860-1869年學者們開始對甘草進行化學方面有關的研究[2]，研究表明，甘草中含有許多藥用成分.多糖是生物體的重要組成部分，可以從植物，微生物和動物等生物中提取.在體內(nèi)，有許多重要的生物功能，如防御功能、結(jié)構(gòu)支持和儲能，同時，多糖在細胞和細胞之間，細胞與外界之間的能量和物質(zhì)轉(zhuǎn)化中起重要作用.作為甘草的重要活性成分之一，許多研究表明甘草多糖具有抗腫瘤，抗炎，抗病毒[3-5]，免疫調(diào)節(jié)，抗氧化和抗菌等生理活性[6，7]，常用的提取法主要有超聲輔助提取法、溶劑浸提法等[8-12].

本研究利用水提醇沉法從甘草中提取甘草粗多糖，進行分離純化并對提取的粗多糖和三種分級多糖進行了光譜性能分析，根據(jù)芬頓反應原理研究了所制備的甘草多糖清除羥自由基的能力，并研究了加入甘草多糖對醬油試樣的羥基的清除能力的影響.

2 實驗部分

2.1 儀器和材料

紅外光譜儀（Nicilet iS5），紫外光譜儀（普析），SHD-（III）循環(huán)真空泵（河南予華），可見光度計（菁華科技）;雙氧水（30%，沈陽華東試劑），抗壞血酸（紅巖試劑，硫酸亞鐵銨（雙船化學試劑），甲醇（國藥），無水乙醇（國藥），磷酸氫二鈉（國藥），二甲亞砜（沈陽華東試劑），正丁醇（恒興化學試劑），三氯化鐵（泉瑞試劑），其他試劑（KH2PO4，乙二胺四乙酸二鈉，三氯甲烷，茚三酮等）均購于國藥集團.

2.2 試劑配制

（1）0.2mol/L的PBS溶液（pH=7.4）：準確稱量35.8010gNa2HPO4·12H2O，溶于500ml蒸餾水中，標為液①;準確稱量3.1120gKH2PO4·2H2O，溶于100ml蒸餾水，標記為液②;適量混合①號溶液和②號溶液配制所需緩沖溶液.

（2）2.0mmol/L的EDTA-Fe（II）溶液：EDTANa2溶液（4.0mmol/L）：EDTANa2 0.3721g溶于250ml超純水，記為溶液①，精確稱量硫酸亞鐵銨0.3923g溶于250ml蒸餾水記為溶液②，將①、②兩種溶液按1：1的體積比進行混合，得到2.0mmol/L的EDTANa2-Fe（II）溶液.

（3）0.52mg/mL的番紅花紅T溶液、6%的H2O2溶液、0.2%的水合茚三酮溶液的配制

準確稱量藏紅花紅T0.0525g溶于超純水中，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，定容，備用.量取10ml30%的H2O2，并轉(zhuǎn)移至50ml的容量瓶中后定容.在100ml容量瓶中準確稱取0.2010g茚三酮，將其溶解在乙醇中，稀釋至刻度并備用.

（4）配制5%的FeCl3溶液：在10ml容量瓶中準確稱取0.5000gFeCl3，將其溶解在超純水中，并稀釋至刻度.

2.3 多糖的提取與分級

用粉碎機將天然甘草破碎過，分別脫脂、脫色，按一定比例加入溶劑攪拌均勻，靜置后置于80℃的水浴鍋中恒溫6h，冷卻至室溫后離心分離，然后將殘余物保持在燒杯中，重復上述步驟三次.將濾出四次的濾液合并，置于燒杯中，在60℃的水浴中濃縮至沒有水層后冷卻至室溫.按體一定體積比加入乙醇密封靜置36小時后過濾.將沉淀物用少量甲醇洗滌三次，并將沉淀物置于干燥的容器中真空干燥后的產(chǎn)品即為甘草粗多糖.稱取一定量的粗糖，加入蒸餾水，加熱至60℃使多糖充分溶解后冷卻至室溫后過濾，然后加入無水乙醇，當醇的濃度達到20%時會產(chǎn)生大量的棕色沉淀，靜置、抽濾，干燥后所得物質(zhì)即為“水提1級多糖”.再將乙醇繼續(xù)加入上述保留的濾液中，在溶液中得到濃度為40%的無水乙醇，得到沉淀物“水提2級多糖”，如上所述繼續(xù)向母液中加入乙醇，使醇的濃度至60%，得到“水提3級多糖”，其他分級操作與1級糖的相同.

2.4 甘草多糖清除各樣品羥自由基

分別在六個試管中，吸取三毫升上述配制的PBS緩沖液，再加1.5ml濃度為2.0mmol/L的EDTA二鈉鐵，0.45ml的濃度為0.51mg/mL的番紅花紅T溶液，然后加入2.0毫升不同濃度的多糖，加入0.9ml的6%H2O2溶液后稀釋至10毫升.將混合溶液置于40℃的恒溫水浴中半小時，在520nm的波長處測定樣品吸光度.由測得的各空白和樣品的吸光度值計算清除率E（%），計算公式如下：

E（%）=（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）*100%

3 結(jié)果和討論

3.1 甘草多糖的顯色特性

本研究對提取的甘草多糖進行了三氯化鐵和茚三酮實驗，結(jié)果表明每種甘草多糖和三氯化鐵（FeCl3）溶液樣品反應溶液均變黃，表明不存在烯醇、酚羥基.在茚三酮顯色實驗中，發(fā)現(xiàn)部分多糖溶液變成紫色，表明含有氨，此結(jié)果與UV的結(jié)論一致.

3.2 紫外光譜研究

對所提取各多糖試樣進行了紫外吸收測試，實驗在200-900nm波長范圍內(nèi)進行.從紫外光譜測試結(jié)果可以看出，粗多糖，水提取物一級，二級和三級多糖均有吸收峰，表明粗多糖和每種分級的多糖含有蛋白質(zhì)或核酸.

3.3 紅外光譜

設定紅外光譜儀的試驗條件，用溴化鉀壓片法制備粗多糖和各分級水提多糖紅外試樣，在4000-600cm-1之間依次掃描壓制樣品，獲得相應多糖樣品的紅外光譜，紅外特征峰的數(shù)據(jù)示于表1.

以圖2粗多糖為例，從紅外光譜可以看出，在3450.4cm-1處有一個強而寬的吸收峰.這是多糖中的O-H伸縮振動吸收峰;在1635.4cm-1處是C=O的伸縮振動吸收峰;1257.3cm-1處的吸收峰是由糖環(huán)中醚環(huán)C-O-C的C-O伸縮振動引起的吸收峰;在1089.5cm-1處的強吸收峰是由糖環(huán)C-O-H的C-O伸縮振動引起的吸收峰;915.3在cm-1處是β-糖苷鍵的特殊吸收峰;α-糖苷鍵在859.6cm-1處具有特定的吸收峰，表明在水提粗多糖中存在β-糖苷鍵和α-糖苷鍵.

3.4 甘草多糖對羥自由基清除能力的活性研究

我們探討了甘草多糖對羥自由基的清除能力，原理為在Fe2+存在時，與H2O2可生成·OH的同時還生成Fe3+，反應方式如下：H2O2+Fe2+→·OH+OH-+Fe3+，而·OH又可使翻紅花紅T褪色，基于以上原理可通過分光光度計法來檢測甘草多糖對羥自由基清除能力.本研究提取的四種甘草多糖各試樣的清除羥自由基能力見表2，對應EC50值的大小見圖3.

由以上實驗結(jié)果可知，EC50由小到大排列依次為1級多糖>粗多糖>2級多糖（EC50）>3級多糖（EC50）>抗壞血酸（EC50），由上述結(jié)果可知提取的多糖的羥自由基清除能力強于對照品（抗壞血酸）.同時，也表明隨著甘草水提分級的增加，羥自由基的清除能力降低.

本研究也探討了加入甘草多糖對醬油試樣的羥基自由基清除能力的影響，結(jié)果表明，加入甘草多糖后醬油試樣對羥基的清除能力明顯的增強.

4 結(jié)論

本文是以甘草為原料，采用水提醇沉法提取了甘草多糖后對甘草多糖進行分級，分別得到水提一級、二級，三級糖.用紫外、紅外等方法對提取的多糖進行了表征，根據(jù)芬頓反的原理研究了所制備的甘草多糖清除羥自由基的能力，并在醬油試樣中添加提取的多糖后，研究了其羥基自由基清除能力，結(jié)果表明，加入甘草多糖的醬油試樣對羥基的清除能力有明顯的增強.

參考文獻：

〔1〕陳橙，帕麗達.阿不力孜，米仁沙.亞庫甫，脹果甘草酸性多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及免疫活性測定[J].2017，21（10）：1110-1112.

〔2〕賀敏，呂慧英，梁逸曾.甘草化學成分分析（英文）[J].湘潭化工學院化學工程與制藥系，2014，27（4）：290-295.

〔3〕Ikegami N.Prophylactic effect of long-term oral administration of glycyrrhizin on AIDS development of a symptomatic patients.PO-825-0596 IX International Conference on AIDS，Berlin，1993.

〔4〕Chen M，Christensen S.B，Theander T.G，Kharazami A.Antileishmanial Activity of Licochalcone A in mice infected with Leishmania major and in hamsters infected with Leishmania donovani. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy，1994，38：1339-1344.

〔5〕張澤生，史珅，楊超慧，等.甘草多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J]，現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2008，8（10）：1855-1837.

〔6〕王忱.甘草多糖抑瘤的體內(nèi)實驗及其分子機制的研究[D].天津醫(yī)科大學，2002.1213-1215.

〔7〕魏煒.甘草藥用成分的萃取、分離、純化方法研究[D].大連：大連理工大學，2005.

〔8〕劉樹興，唐孟忠.“米邦塔”食用仙人掌多糖分級新方法的研究[J].食品工業(yè)科技，2006（4）：108-109.

〔9〕郭立山.郁金中水溶性多糖的梯度分離和含量測定[J].中醫(yī)藥學報，1996（4）：48-49.

〔10〕蔡亞平，韓學忠.五味子多糖分級注射劑的含量和性質(zhì)測定研究[J].中草藥，2010，32（7）：228-230.

〔11〕劉湘，汪秋安.天然產(chǎn)物化學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010.