USP47通過(guò)促進(jìn)抗凋亡蛋白表達(dá)介導(dǎo)頭頸鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥

童 桐，秦 星，謝 非，蔣英英，石劍波，張建軍

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面頭頸-腫瘤科，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海200011

頭頸部惡性腫瘤患者的病死率較高，其中90%屬于鱗狀細(xì)胞癌［1］，簡(jiǎn)稱(chēng)頭頸鱗癌（head and neck squamous cells carcinoma，HNSCC）。盡管有許多針對(duì)HNSCC 的新療法，但“手術(shù)+化學(xué)治療（化療）+放射治療（化療）”的三聯(lián)療法仍是治療HNSCC 的主要方法［2-3］。順鉑（cisplatin，DDP） 是治療HNSCC 常用的化療藥物之一［4］。許多患者在DDP 治療的早期階段獲得了良好的效果，但會(huì)隨著時(shí)間的推移而發(fā)生耐藥［4］。研究［5］結(jié)果表明，超過(guò)70%的HNSCC 患者因?yàn)閷?duì)DDP 產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。因此，了解DDP 耐藥的潛在機(jī)制并制定有效的抵抗DDP的耐藥策略是臨床上需要解決的問(wèn)題。

泛素化是主要的蛋白翻譯后修飾方式之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［6］。泛素化是可逆的，主要通過(guò)去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUB）從底物蛋白上裂解泛素，編輯泛素鏈并加工泛素前體［6-7］。DUB作為E3泛素連接酶的拮抗劑，是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的組成部分［8］。根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)域保守性，DUB 分為6 個(gè)家族：泛素特異性蛋白酶家族（ubiquitinspecific proteases，USPs）、泛素羧基末端水解酶家族（ubiquitin carboxy-terminal hydrolases，UCHs）、Joesphin結(jié)構(gòu)域蛋白家族（Machado-Josephin domain-containing proteases，MJDs）、卵巢腫瘤蛋白酶家族（ovarian tumour proteases，OTUs）、與含泛素的新型DUB家族相互作用的基序（motif-interacting with ubiquitin-containing novel DUB family，MINDYs）和JAMM 家族（JAB1、MPN、MOV34 family）［7，9］。其中，USPs是數(shù)量最多的一類(lèi)DUB［10］，并在各種生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用。

去 泛 素 化 酶47 （ubiquitin specific peptidase 47，USP47）是USPs的成員之一［7-8］，在調(diào)節(jié)細(xì)胞活力和維持基因組完整性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［10-11］。USP47 可以促進(jìn)肺癌和前列腺癌細(xì)胞Wnt 信號(hào)通路的活化［11］，也可以調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［12］。在胃癌中，USP47 還被證實(shí)可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的化療耐藥性和生存能力，并且被認(rèn)為是一種新的治療靶標(biāo)［8］。但是，關(guān)于USP47 在HNSCC 發(fā)病進(jìn)展和治療過(guò)程中發(fā)揮的作用，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建人HNSCC的DDP耐藥細(xì)胞株，探索USP47 與HNSCC 的DDP 耐藥之間的關(guān)系及潛在的機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)DDP耐藥的臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

高糖DMEM 培養(yǎng)基（源培，中國(guó)），10%胎牛血清（CellMax，中國(guó)），DDP 注射液（豪森藥業(yè)，中國(guó)），PrimeScriptTMRT reagent Kit （TaKaRa，日本），SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa，日本），LipofectamineTM2000 Transfection Reagent（Invitrogen，美國(guó)），4%～20%SurePAGE 蛋白預(yù)制膠（GenScript，中國(guó)），鼠單克隆GAPDH抗體（Proteintech，美國(guó)；1∶10 000），鼠單克隆USP47抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)；1∶500），兔多克隆重組人B 細(xì)胞淋巴瘤因子2 xL（recombinant human B-cell leukemia/lymphoma 2 xL，Bcl-xL）抗體（ABclonal，中國(guó)；1∶2 000），兔多克隆X-連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）抗體（Proteintech，美國(guó)；1∶2 000），鼠單克隆Ubiquitin抗體（CST，美國(guó)；1∶2 000），熒光二抗（LI-COR Biosciences，美國(guó)；1∶10 000），MTT（Sigma，美國(guó)），Annexin V FITC Apop Dtec Kit I 100Tst（BD Pharmingen，美國(guó)），Protein A/G免疫沉淀磁珠（Bimake，美國(guó)），MG132（Selleck，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人HNSCC 細(xì)胞系WSU-HN4 （HN4）、WSU-HN30（HN30）由美國(guó)馬里蘭大學(xué)牙醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送。HN4、HN30細(xì)胞均用高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL）培養(yǎng)，放置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 DDP耐藥株構(gòu)建

采用濃度逐步遞增法構(gòu)建人HNSCC細(xì)胞的DDP耐藥株，DDP濃度依次為5、7.5、10、15、20 μmol/L。具體操作方法是在細(xì)胞傳代時(shí)向培養(yǎng)基中加入終濃度為5 μmol/L的DDP，連續(xù)傳代培養(yǎng)至細(xì)胞可以在此DDP濃度的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)。再按前文所述的濃度梯度增加DDP劑量。將耐受DDP的HN4和HN30細(xì)胞株分別命名為HN4/DDP和HN30/DDP。

1.4 USP47基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

采用慢病毒感染法構(gòu)建USP47 基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（USP47 基因過(guò)表達(dá)及對(duì)照慢病毒均購(gòu)于上海漢尹公司）。細(xì)胞用胰酶消化、計(jì)數(shù)后，重懸成單細(xì)胞懸液并接種至6 孔板，以24 h 后貼壁細(xì)胞密度為20%～30%為宜；待細(xì)胞密度為40% 左右，根據(jù)感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值計(jì)算加入病毒懸液的體積，同時(shí)加入聚凝胺（終濃度為10 μg/mL）搖勻；72 h后用含10 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，連續(xù)培養(yǎng)1 個(gè)月后進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。USP47 基因過(guò)表達(dá)和對(duì)照組細(xì)胞分別命名為USP47 和Vector。

1.5 USP47基因敲除細(xì)胞株構(gòu)建

采用慢病毒感染法構(gòu)建USP47 基因敲除細(xì)胞株（敲除對(duì)照慢病毒及敲除慢病毒購(gòu)于上海漢尹公司），USP47基因敲除組和對(duì)照組細(xì)胞分別命名為KO USP47 和KO NC。具體步驟見(jiàn)“1.4”。

1.6 小干擾RNA轉(zhuǎn)染

使用XIAP 和Bcl-xL 基因各自特異的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA） 序列（Genomeditech，中國(guó)）分別敲減USP47 基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞中XIAP mRNA 和Bcl-xL mRNA 的 表 達(dá)。 使 用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent進(jìn)行siRNA 的轉(zhuǎn)染。細(xì)胞接種至6 孔板中，以貼壁后細(xì)胞密度為30%～40%為宜；轉(zhuǎn)染前，換雙無(wú)培養(yǎng)基；按照每孔siRNA 終濃度為50 pmol/L 的量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。XIAP和Bcl-xL基因特異的siRNA序列見(jiàn)表1。

表1 XIAP和Bcl-xL基因特異的siRNA序列Tab 1 siRNA sequences specific for XIAP and Bcl-xL genes

1.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞DDP半數(shù)抑制濃度

細(xì)胞的DDP 半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）主要通過(guò)MTT 法進(jìn)行檢測(cè)。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化、計(jì)數(shù)后，重懸成單細(xì)胞懸液，并接種至96孔板中，每孔100 μL，細(xì)胞數(shù)為3 000個(gè)；以相同體積培養(yǎng)基孔為空白對(duì)照；設(shè)置10 個(gè)DDP 濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將正常培養(yǎng)基換成含有DDP 的培養(yǎng)基；72 h 后，向每孔中加入10 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，小心棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，避光搖勻；用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)下各孔的吸光度［D （490 nm）］。利用Graphpad prism 7軟件計(jì)算IC50。

1.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

用全細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度；取蛋白裂解產(chǎn)物（40 μg/孔）置于4%～20%SurePAGE 蛋白預(yù)制膠中進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后，再用90 V恒壓電轉(zhuǎn)；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入U(xiǎn)SP47（1∶500）、GAPDH（1∶10 000）、XIAP（1∶2 000）、Bcl-xL（1∶2 000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗滌3次，10 min/次；加入與一抗相同種屬的二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌3次后，顯影觀察。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR

提取細(xì)胞總RNA，使用PrimerScript RT 試劑盒將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行所有實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）反應(yīng)。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，使用β-actin 作為內(nèi)參基因。運(yùn)用△△CT法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從而得到目的基因在樣本中的相對(duì)表達(dá)量。用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物序列，由上海生工生物股份有限公司合成，具體序列見(jiàn)表2。

表2 RT-PCR引物序列Tab 2 RT-PCR primer sequences

1.10 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以每孔100 μL、1 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種到96 孔板上，每組設(shè)3 復(fù)孔。細(xì)胞增殖測(cè)定采用MTT 法。每天向每組的3個(gè)復(fù)孔中加入10 μL MTT，培養(yǎng)箱中靜置4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光搖勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)D（490 nm）。

1.11 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種到6 孔板中（每孔約500 個(gè)細(xì)胞），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～15 d，直至形成可見(jiàn)的克隆。PBS 洗滌2～3 次，用4%多聚甲醛固定30 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。染色后，洗滌、風(fēng)干、拍照。

1.12 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡比例。用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次（5 000×g，4 ℃離心5 min），加入1×結(jié)合緩沖換液重懸，300×g，4 ℃離心10 min，棄上清，加入Annexin V和PI（1×結(jié)合緩沖換液=1∶50），混勻、冰上避光反應(yīng)15 min；加入400 μL 1×結(jié)合緩沖換液重懸，轉(zhuǎn)移至流式管中，立即進(jìn)行檢測(cè)。

1.13 泛素化測(cè)定

提取細(xì)胞總蛋白并稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為2 μg/μL，取30 μL樣品留作對(duì)照Input。將上述稀釋好的蛋白樣品等分成2份（每份蛋白總量至少1 mg），用RIPA裂解液稀釋5倍；向稀釋好的2份樣品中各加入70 μL 蛋白A/G免疫磁珠，4 ℃旋轉(zhuǎn)30 min后，1 000×g離心1 min取上清；將上清等分為2份，一份加入目的抗體，一份加入等體積的同種屬的IgG抗體，4 ℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜；第2日，向兩份樣品中各加入60 μL蛋白A/G免疫磁珠，室溫旋轉(zhuǎn)4 h，1 000×g 離心1 min，棄液取沉淀；沉淀用洗雜液反復(fù)漂洗5次后加入60 μL 1×上樣緩沖液，105 ℃金屬浴煮10 min。實(shí)驗(yàn)所得樣品進(jìn)行后續(xù)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組之間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，3 組及3 組以上的比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNSCC細(xì)胞DDP耐藥株的構(gòu)建

以HN4 和HN30 為親本細(xì)胞，采用梯度增加DDP 濃度的方法構(gòu)建DDP 耐藥株HN4/DDP 和HN30/DDP。6 個(gè)月后，DDP 處理濃度達(dá)到20 μmol/L。利用MTT 法分別檢測(cè)DDP 對(duì)親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的IC50。親本細(xì)胞HN4的IC50為6.62 μmol/L，而 耐 藥 細(xì) 胞HN4/DDP 的IC50為49.56 μmol/L（為HN4的7.49倍）；親本細(xì)胞HN30的IC50為4.37 μmol/L， 而 耐 藥 細(xì) 胞HN30/DDP 的IC50為42.14 μmol/L（為HN30的9.64倍）（圖1A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證耐藥性的持續(xù)能力，將HN4/DDP 和HN30/DDP 在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后，檢測(cè)各自的IC50。結(jié)果顯示：HN4/DDP 的IC50仍高達(dá)36.74 μmol/L，而HN30/DDP 的IC50也達(dá)到34.98 μmol/L（圖1B）。

2.2 DDP耐藥株中USP47蛋白表達(dá)的變化

通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HN4、HN30、HN4/DDP和HN30/DDP中USP47蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，HN4/DDP和HN30/DDP中USP47蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖2），且表達(dá)量與DDP耐受濃度呈正相關(guān)。

圖1 DDP耐藥HNSCC細(xì)胞株的構(gòu)建Fig 1 Construction of DDP-resistant strains of HNSCC

圖2 DDP耐藥細(xì)胞株HN4/DDP和HN30/DDP中USP47蛋白的表達(dá)Fig 2 USP47 protein expressions in DDP-resistant HN4/DDP and HN30/DDP cell lines

2.3 USP47基因過(guò)表達(dá)對(duì)HNSCC細(xì)胞DDP耐藥性的影響

免疫印跡實(shí)驗(yàn)及RT-PCR 結(jié)果顯示，USP47 基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功（圖3A、3B）。運(yùn)用MTT 法檢測(cè)DDP對(duì)USP47基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的IC50（圖3C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)USP47 基因后，DDP 對(duì)HN4 細(xì)胞的IC50由2.98 μmol/L 升至12.34 μmol/L，而DDP 對(duì)HN30 細(xì)胞的IC50由3.76 μmol/L升至7.41 μmol/L。

2.4 敲除USP47 基因提高HNSCC 細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性

RT-PCR 和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)USP47 的敲除效率，結(jié)果表明HN4/DDP 和HN30/DDP 中USP47 的蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A、4B）。通過(guò)MTT 法檢測(cè)DDP 對(duì)處理組和對(duì)照組細(xì)胞的IC50，發(fā)現(xiàn)敲除USP47 基因后，耐藥株HN4/DDP 和HN30/DDP 的IC50均 下 降；HN4/DDP 細(xì) 胞 的IC50由39 μmol/L 降 至26.02 μmol/L，而HN30/DDP 細(xì)胞的IC50由33.45 μmol/L降至20.26 μmol/L（圖4C）。

2.5 過(guò)表達(dá)USP47 對(duì)HNSCC 細(xì)胞增殖、克隆形成及凋亡的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)USP47后，HNSCC細(xì)胞的增殖能力顯著減弱（圖5A），克隆形成能力也下降（圖5B）。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)USP47 后HNSCC 細(xì)胞的凋亡變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)USP47 后，HN4 和HN30 的基礎(chǔ)凋亡率與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變（圖5C）；而在DDP的作用下，過(guò)表達(dá)USP47的HN4和HN30 細(xì)胞，其凋亡率出現(xiàn)明顯下降（圖5D）。

圖3 USP47基因過(guò)表達(dá)增強(qiáng)HNSCC細(xì)胞對(duì)DDP的抵抗能力Fig 3 Overexpression USP47 gene increases cell′s resistance to DDP

圖4 敲除USP47基因逆轉(zhuǎn)HNSCC細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥Fig 4 Knocking out USP47 gene reverses cell′s resistance to DDP

圖5 過(guò)表達(dá)USP47對(duì)HNSCC細(xì)胞的增殖、克隆形成和凋亡的影響Fig 5 Effect of USP47 gene overexpression on cell proliferation,colony formation and apoptosis

2.6 過(guò)表達(dá)USP47促進(jìn)抗凋亡蛋白的表達(dá)

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HN4 和HN30 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)USP47后，抗凋亡蛋白XIAP和Bcl-xL表達(dá)水平均顯著升高（圖6A）；相應(yīng)地，敲除HN4/DDP 和HN30/DDP細(xì)胞中USP47 基因后，XIAP 和Bcl-xL 的表達(dá)水平則明顯下降（圖6B）。進(jìn)一步的泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除USP47 后，XIAP 和Bcl-xL 蛋白的泛素化水平升高，蛋白自身表達(dá)水平下降（圖6C）；而在抑制泛素化蛋白的降解“場(chǎng)所”——蛋白酶體的活性后，XIAP 和Bcl-xL 的表達(dá)水平相比對(duì)照組明顯升高（圖6D）。

案例12：立體幾何引言容易上得平淡無(wú)味，可由下列活動(dòng)導(dǎo)入：大家動(dòng)手試一試用3支鉛筆看能擺出幾個(gè)直角？用6支新鉛筆又能擺出幾個(gè)以他們?yōu)檫叺恼切危?/p>

2.7 抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)阻斷USP47 基因過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的DDP耐藥性

在USP47 基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中，利用siRNA 技術(shù)降低抗凋亡蛋白XIAP 和Bcl-xL 的表達(dá)量，觀察DDP 對(duì)其IC50的影響，結(jié)果顯示（圖7）：HN4 USP47 對(duì)照組細(xì)胞（HN4 USP47+si NC） 的DDP IC50為12.09 μmol/L，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（HN4 USP47+si XIAP 和HN4 USP47+si Bcl-xL）的DDP IC50分別為2.80 和3.71 μmol/L； HN30 USP47 對(duì)照組細(xì)胞（HN30 USP47+si NC）的DDP IC50為7.41 μmol/L，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（HN30 USP47+si XIAP 和HN30 USP47+si Bcl-xL）的DDP IC50分 別 為3.25 和3.80 μmol/L?？沟蛲龅鞍譞IAP 和Bcl-xL 表達(dá)降低阻斷了USP47 基因過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的DDP 耐藥性。

圖6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)USP47過(guò)表達(dá)對(duì)抗凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effect of USP47 overexpression on expression of anti-apoptotic proteins by Western blotting

圖7 抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)阻斷USP47基因過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的DDP耐藥性Fig 7 Down-regulation of anti-apoptotic protein blocks DDP resistance induced by overexpression of USP47 gene

3 討論

大多數(shù)耐藥株的誘導(dǎo)方式是反復(fù)間歇性給予高濃度藥物。在本研究中，若一開(kāi)始即使用高濃度的DDP 刺激細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，很難誘導(dǎo)成耐藥株。因此，本研究采用漸進(jìn)式升高DDP 濃度的方法，并且每一個(gè)濃度都至少傳代3次，以保證提高濃度時(shí)大部分細(xì)胞可以很好地生存。整個(gè)誘導(dǎo)周期在6 個(gè)月左右。采用MTT 法檢測(cè)DDP對(duì)HNSCC細(xì)胞的IC50，判斷DDP耐藥株的誘導(dǎo)情況。誘導(dǎo)成功的2個(gè)細(xì)胞株均在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)檢測(cè)，2個(gè)細(xì)胞株對(duì)DDP的耐藥性是穩(wěn)定的。

DDP 作為治療腫瘤的一線藥物，由于內(nèi)源或獲得性的耐藥性而嚴(yán)重限制了其在臨床中的使用，也因此導(dǎo)致了HNSCC患者總體預(yù)后較差。針對(duì)DDP耐藥性分子機(jī)制的研究較多，例如藥物積累的減少、DNA 損傷修復(fù)的增加、凋亡信號(hào)通路的抑制等。研究［8，13］表明，去泛素化酶在參與轉(zhuǎn)移及凋亡途徑中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，因而被認(rèn)為是癌癥治療中有希望的新型藥物靶標(biāo)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HNSCC 耐藥細(xì)胞中去泛素化酶USP47 表達(dá)量升高，且與DDP 耐受濃度呈正相關(guān)。本研究證實(shí)了USP47 可以提高DDP 對(duì)HNSCC 細(xì)胞的IC50，而抑制USP47的表達(dá)可以降低IC50。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)USP47 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡，同時(shí)抑制細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。機(jī)制研究顯示，USP47 基因過(guò)表達(dá)可以顯著提高抗凋亡蛋白XIAP和Bcl-xL的蛋白表達(dá)量；泛素化測(cè)定實(shí)驗(yàn)證實(shí)了USP47 基因通過(guò)降低抗凋亡蛋白XIAP 和Bcl-xL 的泛素化水平導(dǎo)致其表達(dá)量升高；敲低抗凋亡蛋白XIAP 和Bcl-xL 的表達(dá)明顯阻斷了USP47 基因過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的DDP耐藥性。

XIAP是已知的功能強(qiáng)大的調(diào)控凋亡的蛋白［14］，可以直接抑制半胱天冬氨酸蛋白酶（caspases） 家族的活性［15-16］。XIAP 在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性進(jìn)展、復(fù)發(fā)、預(yù)后以及腫瘤化療耐藥密切相關(guān)［17］。Bcl-xL 蛋白屬于Bcl-2 家族，位于線粒體外膜上，通常與Bcl-2形成同源二聚體抑制細(xì)胞凋亡［18］。有研究［19-20］表明，在DDP耐藥的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到Bcl-xL的表達(dá)顯著升高。本研究結(jié)果證實(shí)了XIAP和Bcl-xL 是去泛素化酶USP47 的潛在底物；USP47 通過(guò)降低XIAP 和BclxL 蛋白的泛素化修飾水平，提高二者的蛋白表達(dá)水平，從而發(fā)揮促進(jìn)HNSCC細(xì)胞化療耐藥的生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，USP47 過(guò)表達(dá)可以抑制HNSCC 細(xì)胞的增殖和克隆形成，通過(guò)降低抗凋亡蛋白XIAP和Bcl-xL的泛素化水平導(dǎo)致其表達(dá)量升高進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，提高HNSCC細(xì)胞的DDP耐藥性。該研究結(jié)果提示USP47可能有望成為治療HNSCC 的潛在靶基因，探討其作用機(jī)制可為DDP耐藥的臨床研究提供新思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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