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    HPLC法同時(shí)測(cè)定桂枝加芍藥湯中8種成分的含量

    2019-09-10 07:22:44韓真真邵長(zhǎng)森張?jiān)?/span>王紹花劉莉林桂濤盛華剛
    中國(guó)藥房 2019年6期
    關(guān)鍵詞:肉桂酸桂皮甘草酸

    韓真真 邵長(zhǎng)森 張?jiān)?王紹花 劉莉 林桂濤 盛華剛

    摘 要 目的:建立同時(shí)測(cè)定桂枝加芍藥湯中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚含量的方法。方法:采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18,流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm(0~35 min,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷)、280 nm(35~65 min,甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚),柱溫為25 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果:芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.125~34.000 μg/mL(r=0.999 9)、28.700~459.200 μg/mL(r=0.999 7)、3.675~58.800 μg/mL(r=0.999 7)、1.235~19.760 μg/mL(r=0.999 8)、2.300~36.800 μg/mL(r=0.999 8)、0.955~15.280 μg/mL(r=0.999 7)、36.000~576.000 μg/mL(r=0.999 7)、1.500~24.000 μg/mL(r=0.999 7);定量限分別為0.135、0.102、0.096、0.033、0.013、0.023、0.663、0.198 μg/mL,檢測(cè)限分別為0.041、0.031、0.029、0.010、0.004、0.007、0.201、0.059 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%(n=6);加樣回收率分別為97.47%~100.76%(RSD=1.33%,n=6)、98.15%~103.50%(RSD=1.82%,n=6)、95.65%~100.84%(RSD=2.38%,n=6)、96.75%~100.32%(RSD=1.31%,n=6)、95.88%~102.75%(RSD=2.52%,n=6)、95.63%~100.63%(RSD=2.00%,n=6)、96.78%~100.45%(RSD=1.35%,n=6)、95.71%~100.48%(RSD=1.80%,n=6)。結(jié)論:該方法準(zhǔn)確、可靠,專屬性好,可用于同時(shí)測(cè)定桂枝加芍藥湯中8種成分的含量。

    關(guān)鍵詞 桂枝加芍藥湯;高效液相色譜法;含量測(cè)定;芍藥內(nèi)酯苷;芍藥苷;甘草苷;甘草素;肉桂酸;桂皮醛;甘草酸銨;6-姜酚

    Simultaneous Determination of 8 Ingredients in Guizhijiashaoyao Decoction by HPLC

    HAN Zhenzhen,SHAO Changsen,ZHANG Yuanyuan,WANG Shaohua,LIU Li, LIN Guitao,SHENG Huagang(College of Pharmacy, Shandong University of TCM, Jinan 250355, China)

    ABSTRACT OBJECTIVE: To establish a method for simultaneous determination of albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol in Guizhijiashaoyao decoction. METHODS: HPLC method was adopted. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (gradient elution) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were 235 nm(0-35 min,albiflorin, paeoniflorin, liquiritin)、280 nm(35-65 min,liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol). The column temperature was 25 ℃, and the sample size was 20 μL. RESULTS: The linear range of albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol were 2.125-34.000 μg/mL(r=0.999 9), 28.700-459.200 μg/mL(r=0.999 7), 3.675-58.800 μg/mL(r=0.999 7), 1.235-19.760 μg/mL(r=0.999 8), 2.300-36.800 μg/mL(r=0.999 8), 0.955-15.280 μg/mL(r=0.999 7), 36.000-576.000 μg/mL(r=0.999 7) and 1.500-24.000 μg/mL(r=0.999 7), respectively. The quantitative limits were 0.135, 0.102, 0.096, 0.033, 0.013, 0.023, 0.663, 0.198 μg/mL; the detection limits were 0.041, 0.031, 0.029, 0.010, 0.004, 0.007, 0.201, 0.059 μg/mL. RSDs of precision, stability and reproducibility tests were all lower than 3% (n=6). The recovery rates were 97.47%-100.76%(RSD=1.33%,n=6), 98.15%-103.50%(RSD=1.82%,n=6), 95.65%-100.84%(RSD=2.38%,n=6), 96.75%-100.32%(RSD=1.31%,n=6), 95.88%-102.75%(RSD=2.52%,n=6), 95.63%-100.63%(RSD=2.00%,n=6), 96.78%-100.45%(RSD=1.35%,n=6), 95.71%-100.48%(RSD=1.80%,n=6). CONCLUSIONS: The method is accurate, reliable and exclusive, and suitable for simultaneous determination of 8 ingredients in Guizhijiashaoyao decoction.

    KEYWORDS Guizhijiashaoyao decoction; HPLC; Content determination; Albiflorin; Paeoniflorin; Liquiritin; Liquiritigenin; Cinnamic acid; Cinnamaldehyde; Ammonium glycyrrhetate; 6-ginger phenol

    桂枝加芍藥湯出自《傷寒論》:“本太陽(yáng)病,醫(yī)反下之,因爾腹?jié)M時(shí)痛者,屬太陰也”。桂枝加芍藥湯由桂枝、赤芍、炙甘草、生姜、大棗等5味中藥組成,具有調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、理脾和中、緩急止痛的功效[1],臨床常用于治療月經(jīng)痛、胃痛、腹痛、胃腸痙攣、慢性痢疾等癥[2-5]。有研究發(fā)現(xiàn),桂枝湯中的桂皮醛、肉桂酸、芍藥苷、甘草酸等均具有抗炎、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛的作用[6-7]。桂皮醛是桂枝中主要的揮發(fā)油成分,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用;肉桂酸是桂枝中主要的有機(jī)酸類成分,具有殺菌、止血、抗腫瘤等作用[8]。芍藥苷為赤芍的主要成分,芍藥內(nèi)酯苷為芍藥苷的同分異構(gòu)體,均具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙及免疫調(diào)節(jié)的作用[9]。炙甘草中的甘草苷可用于治療咽炎、急、慢性咳嗽,具有抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)等作用; 甘草素是炙甘草中含量較高的黃酮類成分之一,為甘草苷的苷元,具有保肝的作用;甘草酸是炙甘草的主要成分,可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為甘草次酸,進(jìn)而發(fā)揮抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛等作用[10],其以甘草酸銨為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。6-姜酚是生姜中主要的揮發(fā)油成分,具有抗炎、止痛、強(qiáng)心、抗血小板聚集、抗氧化、抗腫瘤等作用[11]。目前,關(guān)于桂枝加芍藥湯的研究多為在中醫(yī)辨證論治方面,而對(duì)于化學(xué)成分的定量分析鮮有報(bào)道。為此,本研究建立了同時(shí)測(cè)定桂枝加芍藥湯中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚含量的高效液相色譜法(HPLC),旨在為其質(zhì)量控制提供參考。

    1 材料

    1.1 儀器

    1260型HPLC儀,包括G1311C型四元梯度泵、G1315D型可變波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)器、G1316A型柱溫箱、OpenLABC.01.07[27]色譜工作站(美國(guó)Agilent公司);MS105DU型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士Mettler -Toledo公司);KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    1.2 試劑

    芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):110736-201741,純度:95.7%)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào):111610-201607,純度:93.1%)、肉桂酸對(duì)照品(批號(hào):110786-201604,純度:98.8%)、桂皮醛對(duì)照品(批號(hào):110710-201720,純度:98.0%)、甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào):110731-201619,純度:93.0%)、6-姜酚對(duì)照品(批號(hào):111833-201303,純度:98.0%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品(批號(hào):713A022,純度:98.0%)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;甘草素對(duì)照品(批號(hào):Z20J8X40265,純度:98.0%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,水為純凈水。

    1.3 藥材

    桂枝飲片(批號(hào):17050502)、赤芍飲片(批號(hào):170201)、炙甘草飲片(批號(hào):170507)均購(gòu)自山東省中醫(yī)院,大棗飲片(批號(hào):E2017100901)購(gòu)自濟(jì)南東方大藥店,生姜購(gòu)自濟(jì)南市某超市;經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定分別為樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥嫩枝、毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根、豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根(經(jīng)蜜烘制后得到)、鼠李科植物棗(Ziziphus jujuba Mill.)的干燥成熟果實(shí)、姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的新鮮根莖。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Kromasil C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)(洗脫程序見(jiàn)表1);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):235 nm(0~35 min,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷)、280 nm(35~65 min,甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚);柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

    2.2 桂枝加芍藥湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備

    稱取桂枝9 g、赤芍18 g、炙甘草6 g、生姜9 g、大棗12枚,加水1 400 mL,武火煎煮,煮沸后調(diào)文火保持微沸煎煮,煎煮至藥液約600 mL,8層紗布濾過(guò),濾液加水定容至600 mL,即得。

    2.3 溶液的制備

    2.3.1 混合對(duì)照品溶液 取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚對(duì)照品適量,分別置于10 mL量瓶中,加75%甲醇溶解并定容,搖勻,得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚質(zhì)量濃度分別為340、1 148、98、494、610、382、1 400、800 μg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述各單一對(duì)照品貯備液適量,置于5 mL量瓶中,加75%甲醇定容,搖勻,得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚質(zhì)量濃度分別為42.5、574.0、73.5、24.7、46.0、19.1、720.0、30.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

    2.3.2 供試品溶液 取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液25 mL,置于100 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,密閉,稱定質(zhì)量,超聲(功率:200 W,頻率:40 kHz)處理10 min,再次稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    2.3.3 陰性樣品溶液 按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備缺桂枝、赤芍、炙甘草、生姜、大棗的陰性標(biāo)準(zhǔn)煎液,再按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備缺桂枝、缺赤芍、缺甘草、缺生姜、缺大棗的陰性樣品溶液。

    2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

    取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,詳見(jiàn)圖1。由圖1可知,在該色譜條件下,理論板數(shù)按芍藥內(nèi)酯苷峰計(jì)應(yīng)不低于7 000,分離度均大于1.5,陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

    2.5 線性關(guān)系考察

    精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 mL,分別置于5 mL量瓶中,加75%甲醇定容,搖勻,得系列線性關(guān)系工作溶液。精密量取上述系列線性關(guān)系工作溶液適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,各待測(cè)成分回歸方程與線性范圍見(jiàn)表2。

    2.6 定量限與檢測(cè)限考察

    精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量,倍比稀釋,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚的定量限分別為0.135、0.102、0.096、0.033、0.013、0.023、0.663、0.198 μg/mL,檢測(cè)限分別為0.041、0.031、0.029、0.010、0.004、0.007、0.201、0.059 μg/mL。

    2.7 精密度試驗(yàn)

    取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL,置于5 mL量瓶中,加75%甲醇稀釋至刻度,搖勻,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。結(jié)果,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚峰面積的RSD分別為0.25%、0.45%、1.43%、0.64%、0.32%、1.34%、2.01%、0.32%(n=6),表明儀器精密度良好。

    2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液適量,分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚峰面積的RSD分別為0.45%、0.87%、1.22%、0.65%、1.34%、2.65%、1.43%、0.69%(n=7),表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

    取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液適量,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,共6份,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚的平均含量分別為0.24、7.35、0.74、0.10、0.15、0.05、1.97、0.07 mg/g,RSD分別為0.62%、0.31%、1.28%、1.12%、1.56%、1.98%、2.73%、0.34%(n= 6),表明本方法重復(fù)性良好。

    2.10 加樣回收率試驗(yàn)

    精密吸取已知含量的標(biāo)準(zhǔn)煎液,共6份,每份2.5 mL,分別加入一定量的單一對(duì)照品貯備液,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

    2.11 耐用性試驗(yàn)

    2.11.1 流動(dòng)相考察 取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液適量,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件(流動(dòng)相中磷酸溶液體積分?jǐn)?shù)分別為0.15%、0.10%、0.05%)進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量,結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明,當(dāng)流動(dòng)相發(fā)生一定程度波動(dòng)時(shí),本法能滿足試驗(yàn)要求,提示其耐用性良好。

    2.11.2 流速考察 取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液適量,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件(流速分別為0.9、1.0、1.1 mL/min)進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量,結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明,當(dāng)流速發(fā)生一定程度波動(dòng)時(shí),本法能滿足試驗(yàn)要求,提示其耐用性良好。

    2.11.3 柱溫考察 取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液適量,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件(柱溫分別為20、25、30 ℃)進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量,結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明,當(dāng)柱溫發(fā)生一定程度波動(dòng)時(shí),本法能滿足試驗(yàn)要求,提示其耐用性良好。

    2.12 樣品含量測(cè)定

    取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液25 mL,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,平行測(cè)定3次,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量,結(jié)果見(jiàn)表5。

    對(duì)中藥復(fù)方制劑進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)需要同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分,而各成分的紫外吸收最大波長(zhǎng)不同,因此采用多波長(zhǎng)含量測(cè)定方法[12]。袁鵬飛等[13]采用HPLC法測(cè)定桂枝湯中9種成分的含量,在230 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷,在254 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)桂皮醛和甘草酸,在280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)沒(méi)食子酸、香豆素、桂皮酸及2-甲氧基桂皮醛。采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行含量測(cè)定時(shí),一般會(huì)選擇某種成分的最大吸收波長(zhǎng)。在前期試驗(yàn)中,筆者采用二極管陣列檢測(cè)器在190~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)8個(gè)待測(cè)成分進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚的最大吸收波長(zhǎng)分別為230、230、240、275、285、290、255、282 nm;研究各成分的光譜圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷在235 nm波長(zhǎng)處均有較大吸收,甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚在280 nm波長(zhǎng)處均有較大吸收;綜合考慮各成分峰的出峰時(shí)間,選擇于235 nm(0~35 min)波長(zhǎng)處檢測(cè)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷,于280 nm(35~65 min)波長(zhǎng)處檢測(cè)甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚。

    本試驗(yàn)對(duì)甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸等不同流動(dòng)相進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以甲醇-水、甲醇-磷酸為流動(dòng)相時(shí),20 min附近處有2個(gè)峰分不開(kāi),以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí),峰形不好,故選擇以乙腈-磷酸為流動(dòng)相;在此基礎(chǔ)上,對(duì)流動(dòng)相的濃度和比例進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相行梯度洗脫時(shí)分離效果最好,出峰穩(wěn)定且峰形尖銳,故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

    桂皮醛和6-姜酚分別為桂枝和生姜中的主要成分,但二者均為揮發(fā)性成分,在煎煮過(guò)程中易揮發(fā),故標(biāo)準(zhǔn)煎液中的含量相對(duì)較低,但考慮到二者對(duì)湯劑整體藥效的發(fā)揮具有促進(jìn)作用[14],故將二者作為指標(biāo)成分 。

    綜上所述,本研究所建方法準(zhǔn)確、可靠,專屬性好,可用于同時(shí)測(cè)定桂枝加芍藥湯中8種成分的含量。

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    (收稿日期:2018-08-20 修回日期:2018-12-09)

    (編輯:陳 宏)

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