安吉白茶白化葉和返綠葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉綠素及其前體物含量的比較

楊熒 呂立堂 趙德剛

摘要：安吉白茶（Camellia sinensis 'Baiye1'）是典型的白化茶樹(shù)品種，為了對(duì)其葉片白化現(xiàn)象進(jìn)行探究，本研究觀察了安吉白茶的白化葉和返綠葉的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)白化葉葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，基粒片層排列疏松散亂，片層間縫隙大，層次不清晰，甚至斷裂不成形，根據(jù)對(duì)葉綠素及其前體物質(zhì)含量的測(cè)定和對(duì)葉綠素合成的相關(guān)基因在兩個(gè)階段葉片中的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mg-proto Ⅸ在白化葉中含量要高于返綠葉，推測(cè)葉綠素合成階段的Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時(shí)受阻，確定安吉白茶發(fā)生白化是由于葉綠體發(fā)育不良，同時(shí)葉綠素合成階段的Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時(shí)受阻所致。

關(guān)鍵詞：安吉白茶;葉綠體;超微結(jié)構(gòu);葉綠素前體物

中圖分類(lèi)號(hào)：S5711

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）06-0071-05國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.013

Comparison of Ultrastructure， Chlorophyll and Precursor Contents of Chloroplasts between Albino Leaves and Green Leaves in Camellia sinensis ‘Baiyel 1’

YANG Ying1，LV Li-tang2*，ZHAO De-gang1，3

（1.College of Tea / Research Institute of Agricultural Bioengineering， Guizhou University， key Laboratory of Germplasm Innovation for Conservation and Protection of Mountain Plant Resources， Guiyang， Guizhou 550025，China;2.Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang，Guizhou 550006，China）

Abstract：Camellia sinensis cv. Baiye1 is a typical albino tea cultivar. In order to investigate the albinism phenomenon of its leaves， the chloroplast ultrastructure of the albino leaves and the green leaves of Camellia sinensis cv. Baiye1 were observed， and it was found that the internal structure of the chloroplasts in the albino leaves was stunted. The grana lamellae were scattered and loosely arranged with big gaps， and the lamellar structure was not clear， even fractured. According to the determination of the content of chlorophyll and its precursors， and the expression of genes related to chlorophyll synthesis in leaves of two stages ， it was found that the content of Mg-proto IX in albino leaves was significantly higher than that in returning green leaves and speculated that the synthesis of Pchlide a from Mg-proto IX was blocked in the chlorophyll synthesis pathway. These results indicate that the albinism of Camellia sinensis cv. Baiye1 was due to chloroplast dysplasiaand the blocking synthesis of Pchlide a from Mg-proto IX.

Key words：Camellia sinensis cv. Baiyel; chloroplast; ultrastructure; chlorophyll precursor

茶湯中含有的茶多酚、氨基丁酸、脂多糖，微量元素錳、鋅、硒，茶坩寧等具保健作用，以茶樹(shù)白化突變體為原料制成的綠茶滋味鮮爽，香氣、外形、湯色、葉底等品質(zhì)優(yōu)秀，提高了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，同時(shí)由于葉綠素含量降低，氨基酸含量明顯增高，使茶樹(shù)白化突變體制成的茶具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]，植物的葉色突變與葉綠素的合成及葉綠體的發(fā)育息息相關(guān)[3-4]，安吉白茶（Camellia sinensis 'Baiye1'）作為典型的白化茶品種，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)返白過(guò)程中氨基酸升高，葉綠素含量則下降[5]。本研究以安吉白茶為研究材料，對(duì)其白化葉和返綠葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉綠素及其前體物含量進(jìn)行比較和研究，以揭示安吉白茶白化的原因。

1材料與方法

11材料

安吉白茶（Camellia sinensis ‘Baiye1’）的白化葉及返綠葉作為研究材料，采樣于中國(guó)貴州六盤(pán)水市六枝特區(qū)黑曬村茶園（由四川引種），白化葉和返綠葉均處于相同的葉片發(fā)育階段，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

12試劑

植物RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit）、Premix TaqTM Version 20 plus dye、DL1000 DNA Marker5、Ehrlich-Hg試劑，三氯乙酸、乙酰丙酮、鹽酸、丙酮、正己烷、氨水、醋酸鈉、磷酸緩沖液試劑（NaH2PO4&Na2HPO4）、冰醋酸、乙醚、戊二醛等（若無(wú)說(shuō)明均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純）。

13主要儀器

分光光度計(jì)（BioPhotoMeter），PCR儀（Bio-rad），凝膠成像系統(tǒng)（XRS+），分析天平BS224S（Sartorius），電泳儀（Bio-rad），精密pH計(jì)pHS-2C（上海虹益），超純水儀（MicroPure），臺(tái)式離心機(jī)X1R（Thermo），超凈工作臺(tái)（上海上凈凈化），制冰機(jī)F100 Compact（Lcematic，高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750（SANYO），移液槍?zhuān)‥ppendorf）、分液漏斗、渦旋振蕩器SK-1（上海梅香）、數(shù)碼相機(jī)1000D（佳能）等。

14實(shí)驗(yàn)方法

141電鏡觀察方法

為了確定安吉白茶白化過(guò)程中其葉綠體是否結(jié)構(gòu)完整（存在或解體），對(duì)安吉白茶白化葉和返綠葉的細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，安吉白茶葉片樣本的制片和觀察方法均參照楊勇驥等人[6]的方法。

142葉綠素前體物質(zhì)含量測(cè)定

為確定安吉白茶白化過(guò)程中是否存在葉綠素合成受阻現(xiàn)象，對(duì)葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素和葉綠素合成過(guò)程中主要的葉綠素前體物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定，其中δ-氨基乙酰丙酸（ALA）的測(cè)定參照Dei等人[7]的方法，膽色素原（PGB）的測(cè)定參照Bogorad等人[8]的方法，原卟啉IX protoporphyrin IX（ProtoIX：）、鎂原卟啉IX Mg-protoporphyrin IX（Mg- Proto IX）和原脫植基葉綠素（Pchlide）的相對(duì)含量測(cè)定參照Rebeiz和Lee等人[9-10]的方法。葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的含量參照張治安等人[11]的方法。

143葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

為對(duì)白化過(guò)程中葉綠素合成過(guò)程進(jìn)行進(jìn)一步的分析，將白化葉和返綠葉的葉綠素合成相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量的測(cè)定，參照Omega公司E.Z.N.A.Plant RNA Kits操作指南進(jìn)行安吉白茶葉片RNA的提取。

cDNA合成參照TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用RTase M-MLV（RNase H-）反轉(zhuǎn)錄酶將提取的安吉白茶總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

用Primer Premier 50軟件，根據(jù)定量PCR引物的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)以下基因引物：白化轉(zhuǎn)綠基因gra（t），核糖核酸還原酶大亞基基因（RNRL1），谷氨酰-tRNA還原酶基因（HEMA1），鎂原卟啉原 IX 單甲酯環(huán)化酶基因（CRD1）設(shè)計(jì)各基因的RT-PCR擴(kuò)增引物（表1）。以茶樹(shù)GAPDH、β-actin基因（actin）作為內(nèi)參，定量分析相關(guān)基因的表達(dá)情況。參照ABI公司的操作指南，使用SYBR Green染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，數(shù)據(jù)分析方法為ΔΔCT法。

144數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Excel 2016和SPSS 23進(jìn)行圖像繪制、統(tǒng)計(jì)分析、方差分析和多重比較，結(jié)果以x±s表示，文中圖表的表示方式均為平均值，文中所有數(shù)據(jù)均是3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，所有圖也為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，誤差線(xiàn)表示3次重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2結(jié)果和分析

21安吉白茶白化葉和返綠葉的葉色觀察

對(duì)安吉白茶白化階段的表型觀察，如圖1所示，安吉白茶白化性狀（圖1-b、c、d）基本出現(xiàn)在芽到芽下三到四葉（圖1中白化的芽、白化的幼葉和白化的成熟葉），白化性狀明顯（圖1-b、c、d），而完全成熟的老葉（圖1中芽下三、四葉以后的老葉）不會(huì)出現(xiàn)白化性狀（圖1- b、c、d）。

22安吉白茶白化葉和返綠葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察

將安吉白茶的白化葉和返綠葉樣本制片，觀察葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在白化葉的細(xì)胞中葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，基粒片層排列疏松散亂，片層間縫隙大，層次不清晰，甚至斷裂不成形（圖2-a、b）;返綠葉中的葉綠體結(jié)構(gòu)良好，形狀多為長(zhǎng)橢圓形或梭形，葉綠體被膜完整，片層結(jié)構(gòu)垛疊整齊，基粒片層和基質(zhì)片層均排列緊致且清晰（圖2-c、d）。從圖2可看出，安吉白茶的白化葉由于其葉綠體發(fā)育不良，使安吉白茶的葉色呈現(xiàn)出白化的性狀（圖1）。

23安吉白茶白化葉和返綠葉葉綠素及其前體物質(zhì)含量的測(cè)定

為確定安吉白茶白化過(guò)程中葉綠素合成過(guò)程[12]受阻的具體階段，本試驗(yàn)測(cè)定了安吉白茶的白化葉和返綠葉中主要的幾種葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素及葉綠素前體物質(zhì)的含量，將白化葉和返綠葉的葉綠素及其前體物質(zhì)的含量進(jìn)行方差分析和多重比較（表2）。從表2可以看出，δ-氨基乙酰丙酸（ALA）、膽色素原（PGB）、糞卟啉原Ⅲ（CoprogenⅢ），原脫植基葉綠素a（Pchlide a）、葉綠素a（Chlorophyll a）、葉綠素b（Chlorophyll b）和類(lèi)胡蘿卜素（Carotenoid）在返綠葉中的含量均高于白化葉，在Mg-proto Ⅸ之前的原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）的含量在兩種葉片中的差異并不顯著（P>005），但由于Pchlide a合成受阻，導(dǎo)致之后的各前體物質(zhì)含量在兩種葉片中都差異顯著（P<005）（表2）。

將返綠葉測(cè)得的各物質(zhì)含量定為100%，并與白化葉測(cè)得的含量進(jìn)行比較（圖4），其中ALA、PGB、CoprogenⅢ、ProtoⅨ和 Pchlide a合成的各前體物質(zhì)含量均為返綠葉高于白化葉，或是差異不顯著（P>005），但Mg-原卟啉Ⅸ（Mg-proto Ⅸ）的含量卻是白化葉高于返綠葉，并且差異顯著（P<005）。從圖4可以發(fā)現(xiàn)，這是由于Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時(shí)受阻，導(dǎo)致Mg-proto Ⅸ積累，因此，白化葉中的Mg-proto Ⅸ含量高于返綠葉。

24與葉綠素合成相關(guān)基因在安吉白茶白化葉和返綠葉中的表達(dá)量

對(duì)安吉白茶的白化葉和返綠葉進(jìn)行Real time-PCR分析結(jié)果如圖5：谷氨酰tRNA還原酶1基因（HEMA1）在白化葉中的表達(dá)量是返綠葉中的060倍，白化轉(zhuǎn)綠基因（gra（t））在白化葉中的表達(dá)量是返綠葉中的052倍，核糖核酸還原酶大亞基基因（RNRL1）在白化葉中的表達(dá)量是返綠葉中的058倍，鎂原卟啉原 IX 單甲酯環(huán)化酶基因（CRD1）在白化葉中的表達(dá)量是返綠葉中的077倍。以上各基因表達(dá)差異較大，HEMA1、gra（t）、RNRL1在白化葉中的表達(dá)量均比返綠葉中的表達(dá)量低。

鎂原卟啉原 IX 單甲酯環(huán)化酶基因（CRD1）編碼的蛋白主要功能是催化Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a，CRD1在白化葉中表達(dá)量低，與本實(shí)驗(yàn)室對(duì)白化葉和返綠葉葉綠素及其前體物質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果相一致。其次，與葉綠素合成相關(guān)的基因HEMA1、gra（t）、RNRL1在白化葉中的表達(dá)量均低于返綠葉，使白化葉中葉綠素含量低于返綠葉。

3結(jié)論與討論

葉綠體的發(fā)育異常和葉綠素的合成受阻都會(huì)導(dǎo)致植物發(fā)生葉色突變[13-14]，本研究通過(guò)對(duì)白化葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，白化葉葉綠體基粒片層排列疏松散亂甚至斷裂不成形，只有些許類(lèi)囊體殘留（圖2），推測(cè)白化葉的葉綠體是在其發(fā)育階段中的基粒構(gòu)建階段受到影響，其葉綠體發(fā)育受到影響而導(dǎo)致安吉白茶葉白化。同時(shí)在對(duì)兩種葉片葉綠素及其前體物含量測(cè)定（表2、圖4）時(shí)發(fā)現(xiàn)，白化葉中Mg-原卟啉Ⅸ（Mg-proto Ⅸ）含量高于返綠葉，推測(cè)是因?yàn)槿~綠素合成階段中Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時(shí)受阻，使Mg-proto Ⅸ在白化葉片中積累[15]，使白化葉中Mg-proto Ⅸ含量高于返綠葉。對(duì)白化葉和返綠葉中與葉綠素合成的相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，編碼催化Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a的鎂原卟啉原 IX 單甲酯環(huán)化酶[16]的基因（CRD1）在白化葉中的表達(dá)量要低于返綠葉（圖5），其他與葉綠素合成相關(guān)的基因（HEMA1、gra（t）、RNRL1）[17]在白化葉中的表達(dá)量均低于返綠葉（圖5），使安吉白茶在白化過(guò)程中的葉綠素合成減少，葉片發(fā)生白化。對(duì)類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，白化葉中類(lèi)胡蘿卜素的含量低于返綠葉，葉綠素沒(méi)有類(lèi)胡蘿卜素的保護(hù)，也會(huì)使葉綠素含量進(jìn)一步降低[18]（表2、圖4）。

通過(guò)上述對(duì)安吉白茶兩個(gè)階段的葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察和對(duì)葉綠素及其前體物質(zhì)含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，安吉白茶在白化期葉綠體結(jié)構(gòu)異常，同時(shí)葉綠素合成受阻，本研究推測(cè)是由于在葉綠素合成階段Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時(shí)受阻及葉綠體發(fā)育不良導(dǎo)致安吉白茶在白化期白化。

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