‘黔核5號(hào)’核桃葉片多酚組分及含量差異分析

陸勝波 張文娥 史斌斌 潘學(xué)軍

摘要：核桃多酚是對(duì)人體有益的功能活性物質(zhì)，常在醫(yī)療保健等方面發(fā)揮重要作用。以貴州省廣泛栽培的優(yōu)良品種‘黔核5號(hào)’為材料，測(cè)定其葉片中多酚組分及含量狀況，為合理開(kāi)發(fā)利用核桃多酚提供理論依據(jù)。采用紫外分光光度法測(cè)定總酚、總黃酮，測(cè)得總酚、總黃酮含量為179 mgGAE-1FW。采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定多酚組分及含量，測(cè)定7種酚酸：沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、丁香酸、丁香醛，4種黃酮類：兒茶素、槲皮素、楊梅素、蘆丁，1種萘醌：胡桃醌。其中綠原酸和蘆丁含量分別為12604 mg-1FW之間。綠原酸和蘆丁是核桃葉片的主要多酚物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：葉片;HPLC;多酚;綠原酸;蘆丁

中圖分類號(hào)：S6641

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）06-0054-04國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.009

Analysis of Polyphenols Composition and Content Difference in Leaves of ‘Qianhe5’Juglans sigillata Dode

LU Sheng-bo，ZHANG Wen-e*，SHI bin-bin，PAN Xue-jun

（College of Agriculture/ Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Walnut polyphenols are useful functional substances for the human body and often play an important role in health and medicineThe leaves of 'Qianhe5'（Juglans sigillata Dode）were used as tested materials to determine the components and content of leaves in polyphenols，which provided a theoretical basis for rational development and utilization of walnut leavesThe total phenolics and total flavonoids detected by ultraviolet spectrophotometry were 179 mg GAE-1FW，respectivelyPolyphenol components and content were analyzed by high performance liquid chromatography （HPLC），including seven phenolic acids：gallic acid，chlorogenic acid，caffeic acid，p-coumaric acid，ferulic acid，syringic acid and syringaldehyde; four flavonoids：catechin，quercetin，myricetin，rutin; as well as one naphthoquinone：jugloneThe amounts of chlorogenic acid and rutin were 12604 mg-1FW，respectively，which were significantly higher than other polyphenols components，and the remaining components were about 022 ～ 2534 mglang=EN-US>gallic acid，chlorogenic acid，caffeic acid，p-coumaric acid，ferulic acid，syringic acid and syringaldehyde; four flavonoids：catechin，quercetin，myricetin，rutin; as well as one naphthoquinone：jugloneThe amounts of chlorogenic acid and rutin were 12604 mg

貴州是我國(guó)核桃主產(chǎn)區(qū)之一，境內(nèi)核桃資源豐富，從300 ～ 2700 m的海拔范圍內(nèi)都有核桃分布。根據(jù)調(diào)查，貴州核桃有4個(gè)屬11個(gè)種[1]，其中以鐵核桃類型為主，占核桃資源的80%以上，主要集中在黔西北地區(qū)。近10年來(lái)，貴州核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，全省的核桃種植面積近1000萬(wàn)畝[2]，已經(jīng)成為農(nóng)民增收的重要產(chǎn)業(yè)。這主要得益于從貴州實(shí)生核桃群體中選育出了一批本地適生的優(yōu)良核桃品種，如‘黔核5號(hào)’、‘黔核6號(hào)’、‘黔核7號(hào)’、‘黔核8號(hào)’系列優(yōu)良品種;也發(fā)掘了一批獨(dú)具特色的核桃類型，如“小米核桃”、“串核桃”等具有鮮明特點(diǎn)的核桃類型。在大面積生產(chǎn)核桃過(guò)程中，其枝、葉、青皮等附加物產(chǎn)量巨大，因得不到合理利用而常被廢棄，不僅浪費(fèi)資源還造成環(huán)境污染。

眾所周知，核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，擁有“長(zhǎng)壽果”、“益智果”等美譽(yù)。核桃不僅含多種必需氨基酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3-4]，還含有豐富的多酚物質(zhì)，多酚具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化等功能，在食品、醫(yī)藥、工業(yè)等[5-6]領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。核桃葉片能入藥，一棵核桃大樹的產(chǎn)葉量可達(dá)上百斤，是提取多酚物質(zhì)的良好來(lái)源。貴州省核桃資源豐富，栽培過(guò)程中產(chǎn)生大量葉片，如能利用葉片提取植物多酚，不僅能提高核桃附加產(chǎn)值，也增加農(nóng)民種植和管理核桃的積極性。了解核桃葉片的多酚物質(zhì)狀況是其開(kāi)發(fā)利用的前提，因此我們以黔西北地區(qū)優(yōu)良品種‘黔核5號(hào)’為材料，測(cè)定其葉片中多酚組分及含量，以期為核桃葉片合理開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1材料和方法

11材料

111試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地為貴州大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)核桃種質(zhì)資源圃，試驗(yàn)材料為高位嫁接6年后的鐵核桃（Juglans sigillata Dode）‘黔核5號(hào)’，果樹生育期正處于初果期狀態(tài)。

112試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取大小、長(zhǎng)勢(shì)一致的10棵核桃樹，于成熟期在樹冠中部外圍采集結(jié)果枝基部復(fù)葉第2片小葉，分為東南西北四個(gè)方位，每個(gè)方位采集5片，每棵樹20片，共200片葉，三次生物學(xué)重復(fù)。葉片用0℃冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，蒸餾水洗凈后迅速用液氮冷凍研碎，分裝保存于-80℃超低溫冰箱備用。

12方法

121主要儀器設(shè)備和藥品

主要儀器：高效液相色譜儀（HPLC）（LC-15C型，日本島津公司）;紫外分光光度計(jì)（UV-2550型，日本島津公司）;高速冷凍離心機(jī)（SORVALL Stratos型，美國(guó)賽默飛公司）;超聲波清洗儀（KQ5200DE型，昆山超聲儀器廠）。主要試劑和藥品：福林-酚試劑，普通甲醇、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純，購(gòu)自貴州凱信生物科技有限公司;色譜甲醇、沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、丁香酸、丁香醛、兒茶素、楊梅素、槲皮素、蘆丁、胡桃醌均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

122多酚物質(zhì)的提取

超聲波輔助提取法（參考王長(zhǎng)雷等[7]）：分別稱取05 g的核桃葉片，于研缽中加入50%的甲醇水溶液10 mL;研磨至勻漿狀態(tài)后轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，在50℃條件下40KHz超聲輔助提取40 min，重復(fù)提取兩次后合并提取液;再經(jīng)4℃的高速冷凍離心機(jī)8000 r/min下離心10 min，減壓濃縮至膏狀;取上清液用50%的甲醇水溶液定容至10 mL，即為多酚提取液，用于總酚、總黃酮和單體酚含量的測(cè)定。

122多酚、總黃酮含量的測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定總酚（參考 Condehernández 等[8]）：首先吸取02 mL多酚提取液于10 mL容量瓶中，接著加入04 mL福林-酚試劑，再加入25 mL 15%碳酸鈉溶液，定容至10 mL;于25℃條件下水浴2 h，在765 nm的紫外分光光度計(jì)下測(cè)定吸光值。用不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液替代多酚提取液，在相同條件下測(cè)定吸光值，并繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后可求得總酚含量，計(jì)算結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量（mgGAE瘙簚g-1FW）表示。

采用鋁離子絡(luò)合法測(cè)定總黃酮（參考 聶繼云 等[9]）：首先吸取05 mL多酚提取液于10 mL容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，再靜置6 min后加入3 mL 4%氫氧化鈉溶液;定容后于25℃條件下水浴15 min，在510 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液替代多酚提取液，在相同條件下測(cè)得吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后可求得總黃酮含量，計(jì)算結(jié)果用蘆丁當(dāng)量mgRE

123多酚組分及含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定多酚組分及含量：LC-15C型高效液相色譜儀，帶自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱為Agilent C18（250 mm × 46 mm，5 μm）。流動(dòng)相A和B分別為08%乙酸、色譜甲醇;多酚提取液用022? μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25℃，流速09 r/min。兩種梯度洗脫法[10]，梯度 1：0 ～ 10 min，10% ～ 20% B;10 ～ 25 min，20% ～ 50% B;25 ～ 35 min，50% B;35 ～ 40 min，50% ～ 55% B;40 ～ 45 min，55% ～ 10% B，檢測(cè)波長(zhǎng)為 280 nm，用于沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、丁香酸、丁香醛、兒茶素的測(cè)定。梯度 2：0 ～ 10 min，10% ～ 40% B;10 ～ 25 min，40% ～ 60% B;25 ～ 35 min，60% ～ 80% B;35 ～ 45 min，80% ～ 10% B，檢測(cè)波長(zhǎng)為 251 nm，用于楊梅素、槲皮素、蘆丁、胡桃醌的測(cè)定。

124數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 170軟件作顯著性方差分析。

2結(jié)果與分析

21葉片總酚、總黃酮含量的測(cè)定

如圖1所示，葉片中測(cè)得總酚含量為179 mgGAEans sigillata Dode）were used as tested materials to determine the components and content of leaves in polyphenols，which provided a theoretical basis for rational development and utilization of walnut leavesThe total phenolics and total flavonoids detected by ultraviolet spectrophotometry were 179 mg GAE

22葉片中多酚組分狀況及含量測(cè)定

葉片中多酚組分及含量如表 1所示，鑒定出沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、丁香酸、丁香醛、兒茶素、槲皮素、楊梅素、蘆丁和胡桃醌共12種單體酚。蘆丁和綠原酸的含量最高，分別為30757 mg

23葉片中多酚含量分布

圖 2為12種多酚物質(zhì)含量分布狀況，可見(jiàn)這12種多酚組分的含量差異較大，其中蘆丁含量最高為6159%，其次是綠原酸252%，接著是楊梅素（507%）和槲皮素（442%），其余多酚含量在004% ～ 147%之間。

3結(jié)論與討論

‘黔核5號(hào)’核桃葉片多酚組分豐富，能測(cè)到多種酚酸和黃酮類物質(zhì)。綠原酸是酚酸中含量最高的物質(zhì)，為12604 mg·100g-1FW。這與很多藥用植物的多酚組分相似，如銀杏[11]、番石榴[12]、檵木[13]、八仙花[14]、艾草[15]等多種藥用植物葉片，可檢測(cè)到綠原酸、沒(méi)食子酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、楊梅素、槲皮素、蘆丁等多種酚酸和黃酮類物質(zhì)，是葉片中發(fā)揮功效的主要成分。表明核桃葉往藥用方向發(fā)展?jié)摿薮?，能作為提取酚酸、黃酮等藥物成分的良好植物源。

在測(cè)定的12種多酚物質(zhì)中，黃酮類含量整體比酚酸類含量高。酚酸物質(zhì)在次生代謝中處于中上游位置，連接著下游的黃酮、花青素、木質(zhì)素等代謝過(guò)程，既是底物又是產(chǎn)物，如咖啡酸、對(duì)香豆酸可以由上游苯丙氨酸生成，又可以通過(guò)不同的酶促反應(yīng)進(jìn)入下游的黃酮、花青苷等途徑[16]。植物代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生多種中間酚酸產(chǎn)物，進(jìn)一步反應(yīng)后才生成穩(wěn)定的黃酮，這可能是檢測(cè)到酚酸含量較少的原因。耿樹香[17-18]、劉基[19]、張春梅[20]等均在鐵核桃的青皮、葉片、內(nèi)種皮等部位檢測(cè)到含量豐富的多酚和黃酮類物質(zhì)，也從中鑒定到了沒(méi)食子酸、綠原酸、槲皮素、胡桃醌等多酚組分。本次試驗(yàn)從核桃葉片中檢測(cè)到較高含量的蘆丁，顯著高于其它多酚組分，為30757 mg·100g-1FW;與其他研究者報(bào)道的結(jié)果相似，如Cosmulescu等[21]在‘Fernette’、‘Vina’、‘Valcor’、‘Hartley’等9個(gè)品種的核桃葉片中測(cè)得蘆丁平均含量為989 mg·100g-1FW，其中‘Valcor’最高為1867mg·100g-1FW，本次測(cè)得蘆丁分別是其平均含量的342倍、最高含量的165倍，這可能與不同品種核桃和地域因素有關(guān)。但均表明核桃葉片中蘆丁含量豐富，可為提取核桃葉片中的蘆丁提供參考和理論依據(jù)。

高液相色譜法（HPLC）是測(cè)定多酚物質(zhì)比較成熟和常用的方法，如吳竹、張啟發(fā)等[22-23]用高液相色譜法檢測(cè)銀杏、煙草中的多酚物質(zhì)，能有效地對(duì)銀杏內(nèi)酯、山奈素等相關(guān)酚類物質(zhì)進(jìn)行鑒定。采用高效液相色譜法檢測(cè)到核桃葉片多酚物質(zhì)含量豐富，具有很好的開(kāi)發(fā)價(jià)值和利用潛力，除了本次試驗(yàn)所測(cè)的12種多酚組分外，還有其它多酚組分需要進(jìn)一步探索。隨著色譜與質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，今后可使用氣質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）、液質(zhì)聯(lián)用（LC/MS）、核磁共振（NMR）等更加先進(jìn)的技術(shù)挖掘核桃葉片中更多的酚類物質(zhì)信息。

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