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    加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德對(duì)哮喘大鼠氣道反應(yīng)性及肺組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

    2019-09-10 07:22:44張鵬楊冬妹聶波桑勉
    世界中醫(yī)藥 2019年6期
    關(guān)鍵詞:炎性反應(yīng)支氣管哮喘哮喘

    張鵬 楊冬妹 聶波 桑勉

    摘要 目的:研究加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德對(duì)哮喘大鼠氣道反應(yīng)性及肺組織中炎性反應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法:選擇雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分為對(duì)照組、模型組、觀察組,制作哮喘模型后給予加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德治療。測(cè)定氣道阻力、肺泡灌洗液(BALF)中炎性細(xì)胞的數(shù)目以及肺組織中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果:模型組大鼠注射乙酰甲膽堿(MCh)后的氣道阻力及BALF中中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)目及肺組織中白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6、干擾素-γ(IFN-γ)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)、CCL19、CCL21的mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05);觀察組大鼠注射MCh后的氣道阻力及BALF中中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)目及肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ、eotaxin、CCL19、CCL21的mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組(P<0.05)。結(jié)論:加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德治療哮喘大鼠能夠降低氣道反應(yīng)性、抑制肺組織中的炎性反應(yīng),在哮喘治療中展現(xiàn)出積極價(jià)值。

    關(guān)鍵詞 支氣管哮喘;茵陳蒿湯;氣道反應(yīng)性;炎性反應(yīng);哮喘;大鼠;實(shí)驗(yàn)

    Abstract Objective:To study the effects of modified Yinchenhao Decoction combined with budesonide on airway responsiveness and expression of inflammatory cytokines in lung tissue of asthmatic mice.Methods:Male SD rats were divided into a control group,a model group and a treatment group.After making asthma model,the mice were treated with modified Yinchenhao Decoction combined with budesonide.The airway resistance,the number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and the expression of inflammatory cytokines in lung tissue were measured.Results:The airway resistance,the number of neutrophils,eosinophils and lymphocytes in BALF and the expression of interleukin-2(IL-2),IL-6,interferon-γ(IFN-γ),eotaxin,CCL19 and CCL21 in lung tissue of model group mice were significantly higher than those of control group(P<0.05).The airway resistance after MCh injection and the number of neutrophils,eosinophils and lymphocytes in BALF and the expression of IL-2,IL-6,IFN-γ,eotaxin,CCL19 and CCL21 in lung tissue of treatment group were significantly lower than those of the model group(P<0.05).Conclusion:Modified Yinchenhao Decoction combined with budesonide can reduce airway reactivity and inhibit inflammation in lung tissue of asthmatic mice,which shows positive value in the treatment of asthma.

    Key Words Bronchial asthma; Yinchenhao decoction; Airway reactivity; Inflammation reaction; Asthma; Rats; Experiment

    中圖分類號(hào):R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.010

    支氣管哮喘是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)疾病,以氣道慢性炎性反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性為基本病理特征,臨床上表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促等。布地奈德是糖皮質(zhì)激素類藥物,被廣泛用于哮喘治療,通過抑制氣道炎性反應(yīng)、舒張氣道平滑肌來發(fā)揮治療作用,但仍有部分患者的哮喘反復(fù)發(fā)作,給患者及家庭帶來較大負(fù)擔(dān)[1-2]。近年來,中醫(yī)藥物在呼吸道疾病治療中的價(jià)值受到了越來越多的關(guān)注,根據(jù)中醫(yī)理論,哮喘屬于“咳嗽”“哮病”“喘證”的范疇,其主要病機(jī)在“脾腎氣虛、痰濁內(nèi)生、伏于肺臟”[3-4]。茵陳蒿湯是具有清熱、利氣、祛痰作用的中藥湯劑,根據(jù)哮喘的中醫(yī)病機(jī)進(jìn)行加減,加用苦參、浙貝母、石葦,車前草、瓜蔞能夠增強(qiáng)該方劑清熱利濕、化痰平喘的作用。為了明確加減茵陳蒿湯用于哮喘治療的價(jià)值,本研究具體分析了加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德對(duì)哮喘大鼠氣道反應(yīng)性及肺組織中炎性反應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物 選擇健康的雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,體質(zhì)量150~180 g。由本醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SYXK(京)2015-0001。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件飼養(yǎng)、20~25 ℃、自由攝食飲水。

    1.1.2 藥物 布地奈德混懸液(阿斯利康公司,批號(hào):H20140475);加減茵陳蒿湯由醫(yī)院藥劑科制備,包括茵陳12 g、梔子6 g、苦參9 g、浙貝母9 g、甘草9 g、瓜蔞9 g、秦艽9 g、石葦9 g、車前草9 g,濃縮得到含有1 g/mL生藥的藥液。

    1.1.3 儀器與試劑 卵清蛋白(OVA)(批號(hào):9006-59-1)、乙酰甲膽堿(MCh)(批號(hào):62-51-1)及氫氧化鋁(批號(hào):1330-44-5)購自Sigma公司;細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè)試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司,具體為UltraSYBR Mixture試劑(批號(hào)CW2601S)、超純RNA提取試劑盒(批號(hào)CW0597)、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(批號(hào)CW0741)。

    1.2 方法

    1.2.1 分組與模型制備 實(shí)驗(yàn)大鼠分為對(duì)照組、模型組和觀察組。模型組和觀察組按照下列方法建立哮喘模型:第1天、第14天時(shí)給予含有0.1 g OVA和1 mg氫氧化鋁的0.2 mL混懸液;第21天開始,將大鼠放置在密閉容器中并給予5 mL 2% OVA溶液霧化吸入以激發(fā)哮喘,1次/d、30 min/次,共激活14次。

    1.2.2 給藥方法 首次激發(fā)哮喘的當(dāng)天,觀察組開始給予10 mL/kg的藥液灌胃,1次/d,同時(shí)在OVA霧化激發(fā)哮喘前給予1 mg布地奈德溶于5 mL生理鹽水、霧化吸入;對(duì)照組和模型組給予10 mL/kg的生理鹽水灌胃1次/d。

    1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

    1.2.3.1 氣道反應(yīng)性測(cè)定 末次激發(fā)哮喘后24 h,給予50 mg/kg的1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,仰臥固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)并安裝小動(dòng)物呼吸機(jī),按照間隔4 min的頻率依次腹腔注射3.125 mg/kg、6.25 mg/kg、9.375 mg/kg、12.5 mg/kg的MCh,注射MCh后記錄氣道阻力。

    1.2.3.2 肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞的測(cè)定 完成氣道反應(yīng)性測(cè)定后,打開胸腔、解剖右側(cè)肺,將0.9 mL生理鹽水注入支氣管并反復(fù)抽吸,得到BALF后以12 000 r/min的速度離心15 min,取細(xì)胞沉淀并用1 mL磷酸鹽緩沖液重懸,用瑞氏染色法染色后在油鏡下觀察中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞并細(xì)胞數(shù)目。

    1.2.3.3 肺組織中細(xì)胞因子的測(cè)定 完成BALF的取材后,解剖灌洗后的右側(cè)肺組織,采用試劑盒提取組織中的RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA并進(jìn)行PCR反應(yīng),所用引物分別為白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)、CCL19、CCL21的特異性引物,根據(jù)PCR反應(yīng)曲線計(jì)算基因的mRNA表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,3組間計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3組大鼠氣道阻力水平比較 注射不同劑量的MCh后,與對(duì)照組比較,模型組大鼠的氣道阻力水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組大鼠的氣道阻力水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    2.2 BALF中炎性反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目 與對(duì)照組比較,模型組大鼠BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)目明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組大鼠BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)目明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    2.3 肺組織中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)量 與對(duì)照組比較,模型組大鼠肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ的mRNA表達(dá)量水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組大鼠肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ的mRNA表達(dá)量水平明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    2.4 肺組織中趨化細(xì)胞因子的表達(dá)量 與對(duì)照組比較,模型組大鼠肺組織中eotaxin、CCL19、CCL21的mRNA表達(dá)量水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組大鼠肺組織中eotaxin、CCL19、CCL21的mRNA表達(dá)量水平明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

    3 討論

    哮喘屬于中醫(yī)“咳嗽”“哮病”“喘證”的范疇,西醫(yī)則認(rèn)為哮喘的特征為慢性氣道炎性反應(yīng)所介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性。根據(jù)《證治匯補(bǔ)》中記載,“哮即痰喘之久而常發(fā)者,因內(nèi)有壅塞之氣、外有非時(shí)之感、膈有膠固之痰,三者相合,閉拒氣道、搏擊有聲,發(fā)為哮病”[5-6]?!疤怠痹凇跋 钡陌l(fā)生中起到關(guān)鍵作用,痰的產(chǎn)生與體內(nèi)脾腎功能失常、水液代謝紊亂有關(guān),脾腎氣虛、痰濁內(nèi)生、伏于肺臟是“哮病”“喘證”發(fā)病的主要病機(jī)[7-8]。西醫(yī)治療哮喘的主要手段是抑制氣道炎性反應(yīng)、促進(jìn)氣道平滑肌舒張,布地奈德是臨床上廣泛應(yīng)用的哮喘治療藥物,屬于糖皮質(zhì)激素,具有強(qiáng)大的抗炎活性,對(duì)抑制哮喘發(fā)作具有良好的效果[9-10]。中醫(yī)治療哮喘的重要手段是針對(duì)脾腎氣虛、痰濁內(nèi)生、伏于肺臟的病機(jī)選用化痰理氣的藥物,近年來也有越來越多的中藥湯劑被用于哮喘的治療[11-12]。

    本研究所采用的加減茵陳蒿湯作為治療哮喘的中藥湯劑,方中茵陳清熱利濕為主藥,梔子清利三焦之火為臣,加用苦參、秦艽以增清熱祛濕之功,石菖蒲、郁金化濕濁、醒脾,石韋、車前草清熱利小便,濕性重濁趨下,虞摶在《醫(yī)學(xué)正傳》中指出:“治濕不利小便,非其治也”。另加浙貝母、瓜蔞清熱化痰,通腑泄熱,肺氣得降。甘草調(diào)和諸藥,緩和藥性。諸藥共奏清熱利濕宣痹、祛除發(fā)病之源、延緩病情進(jìn)展之功效。原方中茵陳蒿、梔子、大黃三味中藥材具有清熱、利氣、祛痰的作用。在原方的基礎(chǔ)上加用苦參、浙貝母、甘草,苦參起到泄腸腑之熱的作用,浙貝母起到清熱降氣化痰的作用,甘草則起到調(diào)和諸味藥物、緩解苦藥苦寒之性的作用。全方組合共奏祛痰、利氣、清熱之功。為了明確加減茵陳蒿湯用于哮喘治療的價(jià)值,本研究首先通過腹腔注射OVA的方式進(jìn)行致敏、霧化吸入OVA激發(fā)哮喘,在注射MAh激活氣道平滑肌膽堿能受體、促進(jìn)平滑肌收縮后觀察氣道阻力:模型組S的氣道阻力水平明顯高于對(duì)照組,提示哮喘動(dòng)物模型出現(xiàn)了氣道阻力升高的氣道高反應(yīng)性癥狀。在建立哮喘模型后采用加減茵陳蒿湯進(jìn)行灌胃治療,觀察結(jié)果顯示:觀察組大鼠的氣道阻力水平明顯低于對(duì)照組,表明加減茵陳蒿湯治療能夠降低哮喘大鼠的氣道阻力、在哮喘治療中展現(xiàn)出積極價(jià)值。

    氣道的慢性炎性反應(yīng)是造成哮喘病程中氣道反應(yīng)性升高的基本病理環(huán)節(jié),氣道平滑肌內(nèi)大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)[13-14]。本研究通過分析BALF中中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目來反應(yīng)氣道平滑肌內(nèi)炎性反應(yīng)細(xì)胞的浸潤(rùn),結(jié)果顯示:模型組大鼠BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)目明顯高于對(duì)照組,加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德治療后BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)目明顯低于模型組,提示加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德治療能夠抑制哮喘大鼠氣道平滑肌內(nèi)多種炎性反應(yīng)細(xì)胞的浸潤(rùn),進(jìn)而有利于減輕氣道炎性反應(yīng)。炎性反應(yīng)細(xì)胞在氣道內(nèi)的進(jìn)入與多種炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的促炎活性及趨化活性有關(guān),IL-2、IL-6、IFN-γ是與哮喘發(fā)生密切相關(guān)的促炎因子[15-17],eotaxin、CCL19、CCL21是與哮喘發(fā)生密切相關(guān)的趨化因子[18-20],本研究對(duì)肺組織中細(xì)胞因子的分析顯示:模型組大鼠肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ、eotaxin、CCL19、CCL21的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德治療后肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ、eotaxin、CCL19、CCL21的表達(dá)水平明顯低于模型組。這一結(jié)果表明加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德治療能夠減少哮喘大鼠肺組織中多種炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá),由此更進(jìn)一步證實(shí)加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德治療能夠抑制哮喘的炎性反應(yīng)。

    綜上所述,加減茵陳蒿湯聯(lián)合布地奈德治療哮喘大鼠能夠降低氣道反應(yīng)性、抑制肺組織中的炎性反應(yīng),今后可進(jìn)一步在臨床中使用加減茵陳蒿湯來治療哮喘并進(jìn)一步驗(yàn)證加減茵陳蒿湯在哮喘治療中的積極價(jià)值。

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    (2019-01-23收稿 責(zé)任編輯:王明)

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